蓝果忍冬花色苷合成bHLH转录因子筛选及LcTT8功能验证

发布时间：2020-04-16 11:09

【摘要】：蓝果忍冬(Lonicera caerulea L.)具有极高的花色苷含量,是提取可食用天然色素的良好资源,更是极具发展潜力的经济保健型果实。蓝果忍冬果实着色是花色苷积累的过程,bHLH蛋白是调控着花色苷生物合成的重要转录因子。然而,关于蓝果忍冬花色苷合成的分子调控机理未见有研究报道。研究蓝果忍冬花色苷合成的调控机制,既能为培育保健型植物品种提供理论基础,同时也可为植物抗逆分子机理的研究提供参考。本研究以蓝果忍冬品种“蓓蕾”为材料,通过转录组测序、生物信息学分析、构建LcTT8-EGFP绿色荧光载体和pBI121-LcTT8过表达载体、转基因、亚细胞定位、实时荧光定量PCR、ELISA酶联免疫吸附、pH示差法、高效液相色谱法(HPLC)等方法,筛选出了参与蓝果忍冬果实花色苷生物合成的bHLH转录因子LcTT8,并进行了基因功能验证。主要研究结果如下:(1)蓝果忍冬bHLH转录因子家族鉴定分析通过NCBI CDD、MEME方法结合蓝果忍冬bHLH家族进化树分析了蓝果忍冬bHLH转录因子蛋白保守结构域和保守基序进行鉴定,结果表明:有43个bHLH转录因子都包含bHLH家族保守结构域HLH(PF00010)或bHLH-MYC_N(PF14215)。几乎所有43个蓝果忍冬bHLH蛋白都含有Motif 1或Motif 2,Motif 1和Motif 2共同构成了蓝果忍冬bHLH转录因子的basic helix-loop-helix保守结构域。并且,研究结果表明,含有类似保守基序的bHLH转录因子之间具有更近的进化关系。(2)蓝果忍冬花色苷生物合成相关的bHLH转录因子的筛选通过blastx将43条蓝果忍冬bHLH家族序列比对到蛋白数据库Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG(evalue0.00001),得到这些序列的蛋白功能注释信息,结果表明:CL484.Contig3_All、Unigene21245_All、Unigene38564_All和Unigene7373_All与花色苷生物合成相关。将43条蓝果忍冬bHLHs和225条拟南芥bHLHs合并构建进化树预测蓝果忍冬转录因子的功能,结果表明:蓝果忍冬bHLHs可分成14个亚族,CL484.Contig3_All和Unigene21245_All聚类在主要调控花色苷合成的Ⅲ f亚族。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了43个蓝果忍冬bHLHs基因在不同组织部位、不同果实发育期的表达模式,结果表明:果实中的CL484.Contig3_All表达量显著高于根、茎、叶、花;且当果实发育到转色期时CL484.Contig3_All表达量剧烈增高。最终筛选出蓝果忍冬果实中调节花色苷生物合成的转录因子CL484.Contig3_All。(3)蓝果忍冬TT8基因的克隆和生物信息学分析通过对蓝果忍冬转录组数据装配得到CL484.Contig3_All的CDs区,命名为LcTT8。将LcTT8基因与克隆载体连接,转入大肠杆菌测序,得到LcTT8核苷酸序列长度为2049bp。LcTT8蛋白质为酸性蛋白(等电点pI为5.09),含有682个氨基酸,分子量为75928.12。预测LcTT8定位在细胞核,可能包含2个蛋白跨膜螺旋结构域,无信号肽位点。同时对LcTT8进行了蛋白三维结构建模预测。将LcTT8与其他植物TT8进行多重序列比对,发现它们具有相似的保守序列。进化树显示蓝果忍冬TT8和甜樱桃(Prunus avium)TT8进化关系最近。(4)蓝果忍冬TT8的亚细胞定位和基因表达分析利用拟南芥原生质体转化法进行了亚细胞定位分析,在转入空载体的拟南芥原生质体中核、膜、质均可见明亮的绿色荧光,而在转入LcTT8-EGFP融合表达载体绿色荧光只富集在细胞核中。通过qRT-PCR分析LcTT8在蓝果忍冬不同组织和不同果实时期的表达模式,结果发现,LcTT8在根、茎、叶、花中表达量低,在果实中表达量极高,是其他部位的4-23倍;果实发育期间,LcTT8表达量先增后减,在果实转色初期达到峰值。(5)蓝果忍冬TT8基因的功能验证构建pBI121-LcTT8重组载体,利用烟草遗传转化体系对LcTT8基因进行功能验证,结果表明,LcTT8转基因烟草的叶片、种皮颜色出现不同程度的加深。pH示差法测量花色苷含量发现,转基因烟草叶片的花色苷含量上升。通过对LcTT8转基因烟草叶片的花色苷合成基因CHS、CHI、F3H、DFR、ANS进行qRT-PCR分析,结果表明,相比野生烟草,LcTT8转基因烟草叶片的F3H、DFR、ANS基因表达量大幅上调。检测LcTT8转基因烟草叶片花色苷合成相关酶活性,结果表明,LcTT8转基因烟草的DFR、ANS酶活性上调最为明显。通过花色苷含量检测和HPLC分析花色苷组分,结果表明,转基因烟草叶片花色苷含量比野生烟草高,且主要是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷高于野生烟草。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S663.9

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本文编号：2629710