MicroRNA1917调控番茄花柄脱落的分子机制研究

发布时间：2020-04-19 00:17

【摘要】：乙烯作为一种重要的植物激素,广泛地参与植物器官形态建成、衰老脱落、开花成熟以及对逆境胁迫的响应等生理生化进程。microRNA(miRNA)可通过靶向激素合成、受体及信号转导关键基因,参与植物体内激素的应答调节。因此,研究miRNA在乙烯诱导的番茄花柄脱落中的作用,将为明确番茄中miRNA调控乙烯应答调节及完善乙烯诱导番茄花柄脱落的分子机制提供理论依据。本研究以"中蔬6号"番茄离体花柄为试材,通过构建脱落前期(0-4 h)和后期(8-32 h)的small RNA(sRNA)和降解组测序文库,筛选出番茄花柄脱落相关miRNA及其靶基因,对关键miRNA(Sly-miR1917)进行超量表达功能验证,以及关键miRNA和靶基因的时空表达模式分析,目的是明确miRNA参与番茄花柄脱落等乙烯相关反应的分子机制,并探讨选择性剪接、miRNA降解等转录后水平调控的发生对乙烯信号应答调节的意义。主要研究结果如下:1.明确参与番茄花柄脱落的miRNA及其靶基因,并筛选出参与脱落的关键miRNA(Sly-miR1917)。结果显示:在番茄花柄脱落进程中共检测到56个已知miRNA和11个新增miRNA的表达,223个靶基因发生降解;这些靶基因主要在细胞膜组分富集,具有结合功能和催化活性,参与代谢通路、植物病原体相互作用及植物激素信号转导;在番茄花柄脱落不同阶段,miRNA的表达模式和对靶基因的调控模式有所不同,并会受到乙烯处理的影响,表明在番茄花柄脱落进程中miRNA和靶基因之间存在着复杂的调控网络。2.明确Sly-miR1917参与番茄乙烯反应的机制。结果显示:Sly-miR1917和SlCTR4svs在器官形态建成、果实发育成熟及花柄中表达模式呈负相关;超表达Sly-miR1917株系黄化苗表现出加强的三重反应,成株叶片偏上性生长,花柄提前脱落,果实成熟加速;超表达Sly-miR191 7株系中CTR下游乙烯信号转导元件表达水平显著上调,VIGS诱导超表达Sly-miR1917植株中EIN2的基因沉默,能够将番茄花柄脱落率降低至野生型番茄水平,表明Sly-miR1917能够通过负调控靶基因SlCTR4svs改变乙烯信号通路,从而参与番茄乙烯反应调控。3.明确番茄花柄脱落进程中Sly-miR1917对其靶基因的调控模式,以及靶基因对Sly-miR1917的反馈调节。结果显示:外显子跳跃和受体位点的改变,导致SlCTR4基因形成3个具有Sly-miR1917结合位点的选择性剪接体,其编码蛋白亚型与S1CTR4同为一簇,且与潘那利番茄、马铃薯、辣椒CTR蛋白有较高同源性;SlCTR4sv1-3在番茄花柄脱落进程中表现出不同的表达模式,其中SlCTR4sv3与Sly-miR1917的时空表达模式互补,且SlCTR4sv3在花柄的分布有很强的离区特异性,表明SlCTR4sv3可能是在花柄脱落进程中受Sly-miR1917负调控的关键靶基因;在抗Sly-miR1917降解的35S:mSlCTR4sv3转基因株系中SlCTR4sv3的表达量显著高于野生型番茄,且高于未突变的35S::SlCTR4sv3,说明SlCTR4sv3表达水平受到Sly-miR1917的严格调控,此外,SlCTR4sv3的高表达会诱导Sly-miR1917的表达量上调,这一现象在35S::mSlCTR4sv3株系中尤为明显,暗示着SlCTR4sv3能够反馈调节Sly-miR1917的表达。4.明确基于Sly-miR1917调控的乙烯信号参与2,4-D的作用机制。结果表明:2,4-D处理能够显著上调番茄AUX/IAA家族成员SlIAA15和SlIAA29的表达水平,Sly-miR1917的表达无显著变化,而靶基因SlCTR4svs显著上调,SlCTR4sv3极显著上调;反义SlIAA29植株无明显表型变化,反义SlIAA15导致植株矮化、顶端优势减弱、叶柄复生小叶,表明SlIAA15可能参与生长素和乙烯信号的交叉路径,35S::SlIAA15表现出2,4-D伤害的表型;35S::ly-miR1917、35S::SlCTR4sv3 和 35S::mSlCTR4sv3 转基因株系对 2,4-D 处理的敏感性不变,暗示着乙烯可能通过其他方面的调控参与2,4-D作用机理。
【图文】：

拟南芥,乙稀

第一章前言逡逑模式和功能各不相同（Ｙｉｎｇ邋ｅｔ址，１９９９；邋Ｔｕ浊ｅｒ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１０）。ＡＣＳ是己^0生物关键限速酶片１１３１巧６１３１．，，２０１２）。研究表明，果实成熟作}0化６１３１．，２０（）３）、机邋ｅｔ邋ａｌ．，２０００；邋Ｏｗｉｎｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００２）、植物激素生长素（Ｔａｔｓｕｋｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０巧和细胞ｅ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００３）等会诱导基因表达，进而影响植株乙^0释放量。逡逑乙榅信号传导路径逡逑乙稀在植物体内的作用受其生物合成、受体感知和信号转导３个方面影响。向遗传学和分子生物学手段对模式植物拟南芥的研究，克隆出乙稀合成及递途径中的相关基因并进行功能分析，构建出一条线型的乙稀信号代谢模０１２；邋Ａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１０；邋Ｌｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１３）（图邋１－１）。逡逑

模式图,拟南芥,模式图,受体

逦．ｒｉＴｒ＾逦ｉ逡逑图１－１拟南芥乙Zf信号转导模式图（引自Ｙａｎｇ，２０１５）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ｅｔｈｙｌｅｎｅ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｉｎ邋Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ邋（Ｙａｎｇ，邋２０１５）逡逑己痛分子首先由内质网膜上的受体家族所感知。在拟南芥中克隆得到５个乙Zf受体逡逑基因，分别为邋ＥＴＲ１邋（ｅｔｈｙｌｅｎｔ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋１）、ＥＴＲ２、ＥＩＮ４邋（ｅ出ｙｌｅｎｅ邋ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ邋４）、ＥＲＳ１逡逑（ｅｔｈｙｌｅｎｅ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｓｅｎｓｏｒ邋１巧口邋ＥＲＳ２邋（Ｈｕａ邋ａｎｄ邋Ｍ巧ｅｒｏｗｉｚ，１９９８邋ａ，ｂ）。乙Zf受体包含氨基端逡逑信号感受结构域、搂基端组氨酸激酶结构域和反应调控结构域。受体是乙^0信号的负调逡逑控因子，在铜离子的参与下，己稀与受体的结合会使受体失活（Ｍａｓｕｄａ，邋１９８７）ＤＣｈｅｎ邋口００７）逡逑指出ＥＴＲ２失活的机制是被泛素２化蛋白酶降解。根据氨基端疏水区结构域个数的不同，逡逑高等植物艺稀受体可分为两个子类：ＥＴＲｌ－ｌｉｋｅ（３个）和ＥＴＲ２－ｌｉｋｅ（４个）（Ｈｕａ邋ｅｔ邋ａｌ．，１９％逡逑ａ）。目前
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S641.2

【参考文献】