皱皮木瓜种质药用成分对遮荫和套袋技术的响应及转录组学分析

发布时间：2020-04-19 12:08

【摘要】：皱皮木瓜为蔷薇科植物贴梗海棠(Chaenomeles speciosa),皱皮木瓜具有极高的药用营养价值,是保健食品和中药的重要来源。本研究通过分析不同种质间皱皮木瓜主要药用成分(齐墩果酸、熊果酸、绿原酸、原儿茶酸)的含量,以及测定了部分微量元素的含量,对皱皮木瓜药用价值进行综合分析与评价,探讨并筛选了皱皮木瓜优质种质资源;其次利用遮荫和套袋技术手段探究其对皱皮木瓜果实中药用成分的调控影响,为提高皱皮木瓜的药用价值提供了试验基础。进而通过皱皮木瓜转录组测序数据、挖掘绿原酸生物合成途径中的关键基因,为今后深层次开发皱皮木瓜基因提供了重要的科学依据,同时为皱皮木瓜深度研究与资源的开发利用积累试验材料。本研究主要结果如下:1.采用高效液相色谱法测定了皱皮木瓜果实中齐墩果酸、熊果酸、绿原酸、原儿茶酸四种化学成分。测定结果显示,齐墩果酸含量最高,高达8.024 mg·g~(-1);其次是绿原酸,高达5.662 mg·g~(-1);同时各种质间含量差异较大,齐墩果酸、熊果酸、绿原酸、原儿茶酸变异系数分别为44.30%、28.67%、32.27%、39.58%。14个种质(M_1-M_(14))中四种成分含量之和最高的是M_(13)(15.530 mg·g~(-1)),最低的是M_6(4.281 mg·g~-1)。2.利用火焰原子吸收法测定Zn、Fe、Mn、Cu、Ca、Mg六种微量元素含量。结果显示,14个种质均含有较多人体必需的微量元素,其中Ca元素的含量远高于其它元素,其次是Mg元素,Fe、Mn、Zn次之,Cu含量最低。其中六种元素含量之和最高的种质是M_4,其Ca元素高达1606.80μg·g~(-1)。不同种质间微量元素含量差异较为明显,Zn、Fe、Mn、Cu、Ca、Mg元素的变异系数分别为27.12%、28.26%、8.28%、18.33%、23.17%、12.66%。3.根据齐墩果酸、熊果酸、绿原酸、原儿茶酸和六种微量元素的测定结果,进行了相关性分析和主成分分析。相关性结果显示,Fe元素与齐墩果酸、绿原酸均呈极显著负相关,相关系数分别为-0.881、-0.753;与原儿茶酸呈显著正相关,相关系数为0.725。Zn元素与熊果酸含量呈显著负相关,相关系数为0.555;与原儿茶酸含量成显著正相关,相关系数是0.617。Ca元素与齐墩果酸呈显著负相关,相关系数为-0.579。Fe元素与Zn元素、Mg元素与Ca元素都成极显著正相关;齐墩果酸与绿原酸之间呈显著正相关,与原儿茶酸呈显著负相关,其他含量间相关性并不显著。这表明通过测皱皮木瓜中这六种微量元素的含量,可推测出其四种酸含量的高低。4.利用遮荫和套袋对皱皮木瓜果实进行试验,旨在探索栽培技术能否提高其药用成分含量。结果表明,通过30天透光70%遮荫处理后,齐墩果酸含量和熊果酸含量明显提高,绿原酸和原儿茶酸的含量则呈降低趋势;经30天套袋处理后,齐墩果酸、熊果酸、绿原酸和原儿茶酸含量均呈现不同程度的减少;说明套袋方式虽一定程度减少了病虫害、农药残留,但不利于药用成分的合成与积累;总的来看,在皱皮木瓜栽培过程中,可进行适当程度遮荫,使植株更加充分的利用光照,促进有机物质的积累,以达到提高部分药用成分的目的。5.本试验利用Illumina sequencing测序平台对皱皮木瓜果实部位进行转录组测序,共获得105,236,920条读段(Reads),过滤后得到的有效读段数据(clean reads)有102,531,308条,占比97.40%,2个样品的高质量clean reads比例均达97%以上;用Trinity对clean reads进行拼接,获得非冗余的基因(unigene)数据109211条,GC含量为46.95%,Q30均大于93%,平均长度为1492bp,N50为1963bp。将这些unigenes序列进行了七大数据库的基因功能注释,包括:Nr,Nt,Pfam,COG/KOG,Swiss-prot,KO,GO。共有109211条Unigenes获得功能注释。GO数据库注释显示63658条unigenes(58.28%)被注释到生物过程、细胞组分、分子功能3个大类,25个子类;有27866条unigenes(25.51%)被注释到了KOG数据库26个功能分类中,其中注释unigenes数量最多的是翻译后修饰,蛋白质转换,分子伴侣功能;以KEGG数据库为依据,将27478条unigenes注释到到129条代谢途径中,其中unigene最多的途径是碳代谢。这为皱皮木瓜分子生物学研究提供了一定数据支撑。6.在M_6 vs.M_8转录组分析中,一共有4254个差异表达基因,其中包括2388个上调基因和1866个下调基因。总共有3313个差异表达基因被分配到分子功能、细胞组分和生物学过程的三大GO分类和41个功能子类中,其中上调表达差异基因有1405条,下调表达差异基因有1908条;将差异表达基因与KEGG数据库的代谢通路进行比对,共有1938条Unigenes注释到114个代谢通路,其中富集最多的KEGG通路是植物激素信号转导。7.绿原酸合成于苯丙烷生物合成途径中,在皱皮木瓜转录组中涉及绿原酸合成的相关酶有四种,分别是苯丙氨酸脱氨酶(phenylalanin ammonia-lyase,PAL)、肉桂酸径基化酶(cinnamate4-hydroxylase,CYP73A)、香豆酸-Co A连接酶(4-Coumarate:Coenzyme A Ligase,4CL)和莽草酸羟基肉桂酰转移酶(shikimate hydroxycinnamoyl transferase,HCT);其中M_6 vs.M_8涉及绿原酸合成途径的差异表达基因有6条,4条上调表达(Cluster-4.63242;Cluster-4.1656;Cluster-4.15617;Cluster-4.9557),2条下调表达(Cluster-4.34315;Cluster-4.43160);这为绿原酸的生物合成研究奠定了基础,为利用基因工程提高种质的绿原酸含量提供了依据。
【图文】：

建库流程,套袋技术,转录组学

木瓜种质药用成分对遮荫和套袋技术的响应及转录组学ragmentation Buffer 中用二价阳离子将得版，随机寡核苷酸为引物，，在 M-MuL用 RNaseH 降解 RNA 链，并在 DNAA 第二条链。纯化后的双链 cDNA 经过序接头，用 AMPure XP beads 筛选 200 MPure XP beads 纯化 PCR 产物，最终获先使用 Qubit2.0 Fluorometer 进行初步t 2100 bioanalyzer 对文库的 insert size 进库有效浓度进行准确定量（文库有效浓理如图 1所示。

序列,转录组,实验流程

图 2 转录组实验流程图. 2 The experimental procedure of transcriptiSeqTM)得到的原始图像数据始测序序列(Sequenced Reads fq)文件格式存储，其中包含(Sequenced Reads)或者 raw re保证信息分析质量，必须对 eads。数据处理的步骤如下：reads；碱基信息)的比例大于 10%的值 Qphred＜=20 的碱基数占
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S661.6

【参考文献】