珍珠黄杨DELLA蛋白家族BsGAI1、BsGAI2基因的克隆及功能分析

发布时间：2020-04-29 11:21

【摘要】：珍珠黄杨树姿苍劲,株型矮小,具有极高的观赏价值,对于珍珠黄杨矮化机制方面的研究却很少报道,GA信号转导途径或生物合成受阻是植物矮化的一个重要因素,DELLA蛋白是GA信号传导途径中重要的负调控因子,本论文研究了珍珠黄杨矮化有关的DELLA蛋白家族BsGAI1、BsGAI2基因,结果如下:(1)利用同源克隆技术和末端快速扩增技术(RACE)获得珍珠黄杨矮化的DELLA蛋白家族的BsGAI1、BsGAI2基因,获得完整的cDNA序列,长度分别为:2576bp、2305bp;编码区长度分别为1884bp、1836bp,分别编码627aa、612aa个氨基酸序列。对BsGAI1、BsGAI2基因编码蛋白的理化性质分析:BsGAI1分子式为C2951H4637N821O928S29,分子量为67.39kD;BsGAI2蛋白的分子式为:C2891H4541N811O908S30,分子量为66.15kD;且两个蛋白均为不稳定的亲水性蛋白。对BsGAI1、BsGAI2基因编码蛋白进行二级结构分析:BsGAI1、BsGAI2基因编码蛋白的二级结构以α-螺旋和随机卷曲为主。在BsGAI1、BsGAI2基因编码的氨基酸序列中具有DELLA蛋白家族所具有的功能活性位点和特征保守单元,N端存在非常保守的DELLA和TVHYNP结构域,C端结构高度保守,存在VHIID、RVER和SAW结构域。(2)对珍珠黄杨BsGAI1、BsGAI2基因在不同组织进行实时荧光定量表达分析,发现珍珠黄杨BsGAI1基因在茎中表达量最高,在根中表达量最低;BsGAI2基因在茎中表达量最高,在花中表达量最低。对BsGAI1、BsGAI2基因在珍珠黄杨不同时期的表达差异进行分析,发现BsGAI1在2016年7月份的叶、茎、根中的表达量比1月、9月相同组织的表达量都高,说明珍珠黄杨在夏季生长旺盛时候,BsGAI1的表达量也会有所增加,而在9月份中,BsGAI1在茎中的表达量比叶和根中有显著的提高,随着时间的推移,BsGAI1在茎中的表达量不断积累而有所增加,表明珍珠黄杨BsGAI1基因在茎节间缩短以致植株矮化起着重要的调节作用。与BsGAI1的表达量相比,BsGAI2在1月、7月、9月的表达量有所差异,BsGAI2在三个月份中的表达量并不是在茎中最高,说明不同基因在不同生长时期植物组织中存在差异表达。(3)利用双酶切法构建BsGAI2的GFP融合表达载体,利用农杆菌介导法将融合表达载体转化到模式植物烟草中,并通过基因组PCR检测、表型分析、GFP荧光检测、IAA和GA3内源激素测定以及喷施外源GA3等方法鉴定转基因烟草和野生烟草的差异。与野生型烟草相比,BsGAI2转基因烟草呈生长减缓,出现矮化的趋势,节间较短、粗壮,长势较慢,根系生长慢,须根较少。利用荧光显微镜的GFP荧光蛋白的信号采集观察转基因烟草和野生型烟草各个组织。发现在转基因烟草嫩茎的木质部有明亮的荧光信号,节间聚焦位置的细胞中能见到明显的荧光聚集的信号,顶芽、叶、根中也有明亮的荧光信号,在野生型烟草未见到有荧光聚集的信号。进行IAA、GA3内源激素测定,发现BsGAI2转基因烟草和野生型烟草的IAA内源激素含量总体上差异不大,而转基因烟草GA3含量比野生型要高些,GA3含量的增加并没有改变植株矮化的状态,说明BsGAI2基因对于植物矮化起着重要的调节作用。喷施外源GA3后,转基因植株和野生型烟草的节间伸长和茎段生长速度加快,说明BsGAI2基因转入野生型烟草中,植株中正常基因的表达水平受到了抑制,造成植株矮化。随着外源GA3的喷施,使得植株体内的GA表达恢复常态,植株的生长状况逐渐恢复到正常水平。
【图文】：

成了复合体 GA/GID1/DELLA 结构，受体 GID1 口袋覆盖着 GA，DELLA 蛋白与的“盖子”相互连接，下游的 F-box 蛋白与复合体 GA/GID1/DELLA 结合在一起 DELLA 的降解，DELLA 蛋白抑制作用被解除，植物可以继续生长，GA 对植物导和其他的 GA 反应也得以继续，，这就是 GA 与其受体 GID1 对 DELLA 蛋白的“（de-repress）模式（图 1.1）[57-59]。

DELLA蛋白的结构示意图
【学位授予单位】：南京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S687

【参考文献】

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本文编号：2644519