四川黄龙沟三种野生杓兰根部内生真菌的研究

发布时间：2020-04-30 01:52

【摘要】：本研究采集四川黄龙沟自然保护区西藏构兰(Cypripedium ribeticum),黄花杓兰(Cypripedium flavum)和无苞杓兰(Cypripedium bardolphianm)的根段。用徒手切片法观察了3种杓兰的菌根结构,并采用菌丝团悬浮液小块培养基、菌根根段组织切块和菌丝团悬浮液涂板3种方法分离根部内生真菌,结合培养形态观察和ITS区段的序列信息对分离到的菌株进行鉴定。通过物种集中性、Simpson多样性指数和.Pielou均匀度指数计算三种杓兰根部内生真菌的多样性。研究主要结果为:1.西藏杓兰、黄花杓兰和无苞杓兰的根部内生真菌通过根表皮的外皮层进入杓兰属植物根部,但没有在中髓柱和维管束细胞区域观察到菌丝侵入。2.菌丝团悬浮液小块培养基分离法的分离效果优于其它两种方法。3.三种杓兰根部分离得到10属15株内生真菌,其中以胶膜菌属最多,占总体分离种类的33.3%。包括胶膜菌属(Tulasnella)有5株,瘤菌根菌属(Epulorhiza)1株,木霉属(Trichoderma)2株,耙齿菌属(Irpex)1株,碳团菌株(Hypoxylon)1株,赤霉菌属(Gibberella)1株,镰刀菌属(Fusarium)1株,肉座菌属(Hpocrea)1株,丛赤壳属(Nectria)1株,黑团孢属(Periconia)1株。分离得到的内生真菌种类有差异性,造成这种差异性的原因可能是共生杓兰生境不同和生长周期不同。4.黄花杓兰根部内生真菌的多样性和均匀度在3种杓兰中最高,其次是西藏杓兰,最后是无苞杓兰。说明在这一生长阶段中黄花杓兰适应外界环境的能力优于西藏杓兰和无苞杓兰。
【图文】：

烧灭菌过的接种针挑取小块培养基，迅速接入高压灭菌的空培养皿中，每个培养皿中逡逑放１０个小块培养基，每个小块培养基之间保持相对均匀距离，外侧小块培养基不要逡逑接触到培养皿内壁，直径９邋ｃｍ的平板大约可以制作３０—４０个小块培养基。（图２－１邋）。逡逑图２－１培养皿中的小块培养基逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｓｍａｌｌ邋ｐｉｅｃｅｓ邋ｏｆ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｐｅｔｒｉ邋ｄｉｓｈ逡逑２．邋３．邋１．邋２菌丝团悬浮液的制备逡逑在超净工作台上，用酒精灯外焰灼烧灭菌过的镊子将三种杓兰菌根根段夹取到盛逡逑满７５％酒精的无菌培养皿中，完全浸泡３０ｓ后，再用灼烧灭菌过的镊子放入１％的逡逑ＮａＣＩＯ溶液中。浸泡３邋ｍｉｎ后夹出，再放入装满无菌水的培养皿中冲洗５—６次后，逡逑８逡逑

干燥的滤纸上，擦干根段表面水分。用灼烧灭菌过的手术刀将根段切成０．１邋—邋０．３邋ｃｍ逡逑的组织切块，平铺在２．３．２．１邋ＰＯＡ培养基平板上。每个培养基平板里按照五角形位置逡逑平铺５个组织切块（图２－２）。记好分离信息后，放入２５邋°Ｃ培养箱中培养。并以没逡逑有加入根段组织切块的ＰＯＡ培养基为对照组。每天观察一次，一旦发现有菌丝从根逡逑段组织组织切块边缘长出，迅速在超净工作台上用灼烧灭菌过接种针挑取菌丝转移到逡逑培养基平板上（配方见２．３．１．３）进行纯化培养。并将剩余的ＰＯＡ培养基放回２５°Ｃ逡逑培养箱中继续培养观察，重复上述试验，直到没有菌丝长出为止。分离得到菌丝重复逡逑纯化过程，用ＰＤＡ培养基平板作为纯化培养基，直到培养纯化得到单一菌落，用ＰＤＡ逡逑斜面培养保存于４邋°Ｃ冰箱中，作为后续试验的材料。逡逑■逡逑图２－２根段组织切片逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｔｉｓｓｕｅ邋ｓｌｉｃｅ邋ｏｆ邋ｒｏｏｔ邋ｓｅｇｍｅｎｔｓ逡逑２．邋３．邋３菌丝团悬浮液涂板混匀分离法逡逑２．邋３．邋２．邋１分离培养基的制备逡逑配置马铃薯燕麦培基（ＰＯＡ），配方为新鲜去皮马铃薯５０克，燕麦８克，琼脂逡逑１７克，蒸馏水１０００毫升，ｐＨ自然，高压灭菌。冷却到４６邋°Ｃ附近时，，按比例依次滴逡逑加入青霉素和链霉素
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S682.31

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本文编号：2645254