苹果抗轮纹病品种鉴定及SA诱导后抗病差异表达基因的RNA-Seq分析

发布时间：2020-05-04 16:38

【摘要】：随着苹果生产中主要的栽培品种的不断变化,导致苹果轮纹病成为我国当前苹果生产上最为严重的病害之一,使苹果产业受到巨大经济损失。本研究利用人工接种苹果轮纹病菌和田间自然发病调查相结合的方法鉴定主要品种的抗病性,并对抗病品种北之幸和感病品种礼泉短富利用SA进行诱导处理,测定诱导前和诱导后以及品种间与抗性相关的一些酶活性变化。进一步通过高通量RNA-Seq测序技术,明确不同处理间与抗轮纹病相关的差异表达基因,对筛选到的差异表达基因进行验证,取得了如下研究结果:1.对中国农科院郑州果树所苹果资源圃中的190个苹果品种进行了苹果抗轮纹病品种抗病性鉴定。(1)通过人工接种苹果轮纹病菌,发现不同苹果品种在不同程度上都感染了苹果轮纹病菌,没有免疫品种,但品种间抗性存在一定的差异。通过聚类分析,高抗品种有15个,占7.89%;中抗品种有77个,占40.53%;中感品种有80个,占42.11%;而高感品种有18个,占9.47%。(2)2012年,2013年连续两年对田间种植的190个供试品种做田间自然发病调查。2012年高抗品种占大多数,中感品种只有1个品种,即礼泉短富。在调查的190个供试品种中,有164个品种的病情指数都在30以下,占调查品种总数的86.32%,但礼泉短富病情指数超过了50。2013总体的抗病趋势与2012年的基本一致,在抗病品种中早熟品种占的比例较高,感病品种大多为富士系列品种,只有北之幸、1996-1-1和秦冠3个高抗品种。2012年和2013年的调查结果中均无高感品种。通过人工接种结合田间自然发病调查筛选出在两年的调查中都表现一致稳定的高抗病性品种北之幸和感病品种礼泉短富。2.以抗病品种北之幸和感病品种礼泉短富为材料,对不同浓度SA处理的苹果叶片进行抗性相关酶活性的测定。结果表明,SA处理北之幸和礼泉短富后,均可使植株体内低水平的PAL、POD、β-1,3-葡聚糖酶和PPO活性在短时间内提高,且明显高于对照植株体内的酶活性。其中抗病品种北之幸的PAL活性较对照提高了1.36-2.73倍;POD活性提高了4.74-6.19倍;β-1,3-葡聚糖酶活性提高了1.71-2.04倍;PPO活性提高了1.88-2.32倍。而感病品种礼泉短富的PAL活性提高了1.32-1.70倍,高浓度处理的PAL活性上升较慢,在第11d达到最大值;POD活性上升速度也较北之幸慢,在第11d达到最大值,较对照升高了4.11-5.68倍;β-1,3-葡聚糖酶升高了1.53-1.82倍;而PPO活性上升比较早,在第7d达到最大值,较对照上升3.13-4.00倍。表明酶活性的增加在不同品种间存在差异,从PPO活性的测定结果中可以看出,在未经SA处理的不同苹果品种中,PPO活性本身就存在一定的差异,抗病品种较感病品种PPO活性高,即在轮纹病发生的初始阶段,抗病品种就能很好的抵御病原菌的入侵。3.以抗病品种北之幸和感病品种礼泉短富为材料,对SA处理前后的苹果样品进行RNA-Seq测序,分析苹果不同品种在SA诱导过程中,同一基因型在诱导前后和不同基因型在诱导前或诱导后的差异基因表达变化,构建了SA诱导不同抗轮纹病品种过程的数字表达谱。主要结果如下:(1)对北之幸和礼泉短富SA处理前后共4个样品进行Illumina测序,共得到35.30M reads。(2)将各样品测序得到的reads与Unigene库进行比对,共得到差异表达基因2590个,其中最大差异表达基因1382个,最小差异基因150个,共表达基因有9个,分别是:MDP0000039357、MDP0000158474、MDP0000223968、MDP0000225361、MDP0000232908、MDP0000329063、MDP0000362305、MDP0000838695和MDP0000916403,在共表达的基因中MDP0000223968、MDP0000329063和MDP0000362305参与了防御机制和应答刺激。(3)在抗病品种北之幸处理组与对照组中,差异表达基因有257个,213个上调表达,44个下调表达。在感病品种礼泉短富处理组与对照组中,差异表达基因有150个,有110个上调表达,40个下调表达。在抗病品种北之幸处理组与感病品种礼泉短富处理组中,差异表达基因有828个,有356个上调表达,472个下调表达。而在抗病品种北之幸处理组与感病品种礼泉短富未处理组中,差异表达基因数目最多,有1382个,540个上调表达,842个下调表达。从结果中可以看出,在同一品种中,SA处理前后差异表达基因中上调表达的基因数目多于下调表达的基因数目,而不同品种间的差异表达基因数目则是最多,且多于同一品种处理前后的差异基因数目。(4)通过对生物信息学的注释,共获得2202条Unigene的注释结果。差异基因数目最多的是整体功能类(General function prediction only),而与抗性相关的功能注释主要涉及防御机制(Defense mechanisms)、信号转导机制(Signal transduction mechanisms)、能量产生与转导(Energy production and conversion)和离子转运机制(Inorganic ion transport and metabolism)。在感病品种礼泉短富中涉及防御机制的差异基因没有注释到。(5)对差异表达基因进行GO功能注释,主要参与的分类有:代谢过程(metabolic process)、应答刺激(response to stimulus)、生物学调控(biological regulation)、免疫系统过程(immune system process)和抗氧化活性(antioxidant activity)。感病品种礼泉短富参与的显著性功能GO分类种类少于抗病品种北之幸,且涉及到的差异表达基因数量也少于北之幸的。(6)对4个样品可能涉及或参与的代谢通路进行分析,结果显示,经SA诱导处理后,不同品种间本身存在的差异表达基因数量明显减少,但参与的显著性功能GO分类和代谢通路数量变化不大,且涉及的范围大致相同。主要涉及或参与的抗病相关代谢通路有:过氧化物酶体途径(Peroxisome,ko04146)、苯丙烷生物合成途径(Phenylpropanoid biosynthesis,ko00940)、萜类化合物生物合成途径(Terpenoid backbone biosynthesis,ko00900)、植物与病原菌互作途径(Plant-pathogen interaction,ko04626)、类黄酮生物合成途径(Flavonoid biosynthesis,ko00941)、植物激素信号转导途径(Plant hormone signal transduction,ko04075)、苯丙氨酸代谢途径(Phenylalanine metabolism,ko00360)和核糖体途径(Ribosome,ko03010)。品种间和品种内的差别在于:在品种间参与的代谢途径有核糖体途径,没有类黄酮生物合成途径;而在品种内参与的代谢途径有类黄酮生物合成途径,没有核糖体途径。且感病品种礼泉短富参与的代谢通路明显少于抗病品种北之幸,而涉及到的与抗病相关的代谢通路则更少。SA诱导处理后,不同抗性品种所产生的差异基因数量明显不同,抗性品种产生的差异基因数量多,感病品种产生的差异基因数量相对较少,且涉及到的代谢通路也少,这与品种间本身的抗病性有关,同时也表明抗病品种的抗性相关基因更易受到SA的诱导。(7)在筛选到的2590个差异基因中,几丁质酶相关基因有304个,其中有170个参与防御机制,120个基因与水杨酸应答有关;葡聚糖酶相关基因有39个,其中有2个基因参与防御机制,2个基因参与苯丙烷代谢途径,9个基因参与氧化还原途径;有2个NPR1相关基因,一个GO注释到参与防御机制;16个WRYK转录因子相关基因,其中5个基因参与防御机制,4个基因与应答刺激有关;3个PR1相关基因均与防御机制有关和1个TGA相关基因。(8)与植物抗病相关的代谢途径:苯丙烷氨类代谢途径和水杨酸信号途径中,都检测到有差异基因的存在,在SA处理前后苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)和4-香豆酸-CoA连接酶(4CL)这3种酶基因不仅在抗病品种中存在差异表达,在感病品种间也存在差异表达。对于类黄酮、木质素、生物碱等具有抗菌活性的中间产物,在抗、感病品种间也存在差异表达。但在水杨酸信号途径中,感病品种礼泉短富差异基因的表达量都较抗病品种北之幸的低。说明除了品种之间本身存在的差异外,外源施用SA更易诱导抗病品种中与水杨酸信号途径相关的差异基因的表达量上调。(9)对6个共表达差异基因、1个葡聚糖转运蛋白基因和2个几丁质酶基因进行Q-PCR验证,验证结果与RNA-Seq测序结果基本一致,仅在表达差异倍数上,两者存在一定的偏差,但上下调表达趋势基本相同。
【图文】：

酸解,苯丙氨酸,叶片,感病品种

中性到性植处度 2才。中的 PAL 活性升高最快SA 处理感到最高值，较性在 11d 时植株，其体用 20mmo处理前期，度的升高，2.35 倍；而才达到最高活性较对照提快。感病品种礼较对照提高达到最高，体内的 PAL 活ol/LSA 诱导两品种体内抗性品种北而感病品种高。SA 诱导提高了 1.36礼泉短富 7d高了 1.32-1.较对照提活性均逐渐导不同抗性内的 PAL 活北之幸在处种礼泉短富被处理后，北6-2.73 倍，后，10mm46 倍。20m提高 1.7 倍。渐下降。性品种苹果，活性相差不处理后 7d，被诱导后，北之幸体内其中以 20mmol/L 和 15mmmol/LSA 诱随着处理时，测定叶片不大，且随处PAL 活性达PAL 活性升PAL 活性较mmol/L SAmmol/LSA 诱诱导的植株时间的延长片中 PAL 活处理时间的达到最高，升高较北之较礼泉短富诱导植株诱导 PAL 株，叶片内长，各浓度活性，结果的延长都有较感病品之幸慢，在富增长快且

苯丙氨酸,抗病作用,抗性品种,清除剂

3.2胞壁内源发生.2 过氧化过氧化物壁中，，它可源活性氧清生了变化（（1）随着化物酶(POD物酶在植物体可催化形成木清除剂。经 S图 3.4、3.5着处理天数D)活性分体内也参与木质素以抵SA 处诱导5 和 3.6）。的延长，P39分析与抗病作用，抵御病原菌的理后，不同POD 活性迅是植物细胞的侵袭。PO同抗性品种迅速提升，不胞内重要的OD 也是植苹果体内的不同抗性品的防御酶。在植物体内重要的 POD 活性品种达到高峰在细要的性都峰的
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.611.1

【相似文献】