百合花香单萜合成关键酶LiDXS基因的克隆与分析
发布时间：2020-05-04 22:28
【摘要】：单萜类物质芳樟醇、(E)-β-罗勒烯、柠檬烯等是百合花香的重要组成成分,其生物合成是质体中的MEP合成途径完成的,该代谢途径上的关键酶和基因在模式植物中已有众多研究,但在百合中尚未见报道。为阐明百合花香单萜类物质的释放规律及其调控机制,本论文以浓香型百合‘西伯利亚’(Lilium'Siberia')为材料,采用离体静态顶空吸附结合自动热脱附气质连用对单萜类物质的时空释放规律进行了研究,利用分子生物学方法,分离获得MEP合成途径的第一个关键酶基因,分析该基因的表达模式,并对其功能进行了验证。主要结果如下:1.单萜类物质的释放在‘西伯利亚’百合的花的不同组织及不同开花时期存在明显的释放规律。单萜类物质在花瓣中释放量较高;随开花进程单萜类物质释放量呈现先升高后降低的挥发模式,花蕾期较少,盛花期升高,衰弱期急剧下降。2.从浓香型百合‘西伯利亚’内轮花瓣中克隆出一个百合花香单萜关键酶基因,命名为LiDXS。该基因全长2479bp,开放阅读框为2199bp,编码732个氨基酸。通过氨基酸序列对比分析,DXS基因同源性在不同物种间较高,且包含两个高度保守的序列WDVGHM和IAENHA。对其进行系统进化树分析,百合LiDXS基因属于DXS2亚家族。3.通过在线WoLF POST预测,将LiDXS蛋白定位于叶绿体上。利用In-Fusion的方法构建融合植物表达载体:pSuper::LiDXS::GFP,通过农杆菌注射本生烟草叶片进行亚细胞定位实验,在激光共聚焦显微镜下观察定位于叶绿体上。4.荧光定量PCR表达结果显示,LiDXS基因在花瓣中特异高表达;在花开过程中,LiDXS基因的表达在整体上呈现先增高后降低的趋势,在盛花期最高。5.将LiDXS基因转入烟草中,利用固相微萃取技术对烟草花朵挥发物进行测定,发现转基因烟草的花中比野生烟草花中的芳樟醇含量显著升高,有显著差异,初步验证了LiDXS基因的功能,进一步证明LiDXS基因可能是百合花香单萜合成途径上的一个关键酶基因。本论文从'西伯利亚'中克隆一条花香单萜合成关键酶基因,并在植物体内对其功能进行验证,对百合花香单萜调控的分子机制有进一步了解,为百合花香育种提供一定依据。
【图文】：
ｅｔ邋ａｌ．，２０１６）。逡逑在细胞质的ＭＶＡ途径中，反应开始于３个乙酰辅酶Ａ的缩合，并涉及６个酶促逡逑反应（Ｍｕｈｌｅｍａｎｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１４）（图１－１）。首先第一步两个单元的Ａｃ－ＣｏＡ在ＡＡＣＴ的作逡逑用下发生克莱森酯缩合反应，生成ＡｃＡｃ－ＣｏＡ，接下来，ＨＭＧＳ催化ＡｃＡｃ－ＣｏＡ与逡逑Ａｃ－ＣｏＡ发生醇醛缩合以形成ＨＭＧ－ＣｏＡ；邋ＭＶＡ的形成ＨＭＧＲ完成，它依赖ＮＡＤＰＨ逡逑催化ＨＭＧ－ＣｏＡ到ＭＶＡ（Ｂｏｃｈａｒｅｔａｌ．，１９９９），随后，合成ＩＰＰ和ＤＭＡＰＰ的剩余步骤逡逑包括通过ＭＫ和ＰＭＫ催化将ＭＶＡ转化为ＭＶＡＤＰ的两个磷酸化反应，之后通过逡逑？卩灄），依赖八丁？，催化＿八０？脱羧形成１？？（？0１＾１１６１吐，２０１４）。同样，０＾也可在逡逑异戊烯基二磷酸异构酶（ＩＤＩ）的作用下生成ＤＭＡＰＰ（Ｈｅｍｍｅｒｌｍ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１２）。逡逑尽管ＭＥＰ途径发生在质体中，ＭＶＡ途径发生在细胞质中，但是都可以通过Ｃ５逡逑化合物ＩＰＰ和ＤＭＡＰＰ缩合斗：成各种化合物
１引言逡逑（４）利用相对定量的方法研[偣丶富颍椋勘泶锕媛桑醪饺范ǎ椋恚蠡蝈义显诎俸系ポ坪铣傻淖饔谩ｅ义希ǎ担┙鲜鲋参锉泶镌靥遄胙滩荩秆⊙粜灾仓辏义嫌霉滔辔⑤腿〖际醵云浠ㄏ慊臃⑽锝校牵茫停硬舛āｅ义希保罚臣际趼废咤义媳狙芯客ü范ā鞑恰ㄏ愕闹饕煞郑莸ポ评辔镏蚀煌揪度范ㄏ靛义狭械墓丶富颍茫遥裕校茫医岷希遥粒茫诺姆椒ǘ怨丶富蚪锌寺。灰环矫嫱ㄥ义瞎煌ń锥位虻南喽远拷岷系ポ评辔镏适头帕康姆治觯范ɑ虮泶镉氲ポ棋义侠辔镏屎铣捎胧头诺墓叵担涣硪环矫嫱ü窍赴ㄎ谎芯亢妥蜓滩莸募际醵曰蝈义系墓δ芙醒橹ぃ范ü丶富蛟诎俸匣ㄏ愫铣芍械淖饔谩ｅ义稀
本文编号：2649086
【图文】：
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