农杆菌介导的火龙果遗传转化体系建立及转LTP基因提高抗寒力研究

发布时间：2020-05-05 04:24

【摘要】：随着火龙果(Hylocereus undulatus(Haw.)BrittonRose)在我国栽培范围的不断扩大,特别易面临低温胁迫的影响,在贵州、云南、广西等南亚热带地区时常会遭遇低温冷害、倒春寒等极端天气危害,栽培的火龙果容易发生冷害和冻害,造成30%左右的减产。近年来,前人在低温胁迫对火龙果生理影响方面开展了一些研究,为抗寒力评价提供了方法,并开展辐照+低温和EMS+低温诱导的研究,初步取得一些抗寒性较好的组培苗。火龙果常规育种受没有抗寒力较好资源的限制,也较少开展。前期的研究中发现通过成年态火龙果茎段诱导的愈伤组织再分化较困难,进而影响到遗传转化效率,国内外的研究中尚未见火龙果遗传转化的相关报道。研究者试图从基因工程、遗传转化等方面来寻求突破,为选育抗寒力提升的火龙果品种提供新的途径和方法。本研究通过开展火龙果花药培养和茎段培养构建再生体系,利用外源LTP基因构建载体,以火龙果花药愈伤组织和茎段为受体分别进行农杆菌介导获得抗性愈伤组织或抗性芽,开展相关鉴定,并对再生植株进行形态观察和抗寒生理测定,旨在为火龙果遗传转化体系的建立和抗寒新品种选育提供重要的技术方案和参考。其主要研究结果如下:(1)从现蕾起观测'紫红龙'火龙果花蕾发育的动态变化,采集从现蕾期起1至13天的花蕾,通过电子显微镜观察火龙果小孢子在不同发育时期的外部形态结构特征及细胞学特征变化,为花药或小孢子培养提供细胞学依据和最佳取材时间,以期建立高效、稳定的火龙果花药或小孢子组织培养体系。结果表明,火龙果小孢子发育经历了四分体时期、单核早期、单核靠边期和双核期,最后发育为成熟花粉粒,每个时期具有明显不同的形态特征;火龙果小孢子发育时期与花蕾的大小和花药的长度紧密相关。火龙果花蕾纵径在5.5～6.0 cm,横径在2.5～3.2 cm,绝大数小孢子发育至四分体时期,此时对应的花蕾发育天数约为4 d;花蕾纵径在6.8～7.6 cm,横径在3.0～3.4 cm,绝大数小孢子发育至单核早期,此时对应的花蕾发育天数约为5 d;花蕾纵径在8.1～8.6 cm,横径在3.3～3.9 cm,绝大数小孢子发育至单核靠边期,此时对应的花蕾发育天数约为6 d;双核期时,花蕾纵径在8.9～10.5 cm,横径在3.8～4.4cm,对应的花蕾发育天数约7～8d。因此,可以根据火龙果花蕾的形态、大小和花药发育时期来确定小孢子最佳培养时期对应的选蕾标准。(2)以'紫红龙'火龙果花药为外植体,研究了小孢子不同发育时期、低温预处理时间、不同植物生长调节剂及浓度配比对花药诱导胚性愈伤组织的影响。结果表明,小孢子发育处于单核初期至单核靠边期的花药,其愈伤组织诱导率最高可达23.9%,但未能诱导出胚状体;而4℃低温预处理48 h,愈伤组织的诱导率可达32.8%;最适花药愈伤组织诱导的培养基为 MS + 2.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D + 60g/L 蔗糖,诱导率为 37.8%,胚性愈伤组织为黄绿色、致密状,外表有颗粒状突起。愈伤组织增殖培养基以MS+ 0.4 mg/LTDZ+ 0.8 mg/L KT效果较好,增殖系数达9.1倍以上。愈伤组织再分化培养基为MS + 0.4 mg/L TDZ + 0.5 mg/L 2,4-D + 0.6 mg/L NAA时,愈伤组织再分化率达36.7%。通过火龙果花药诱导出愈伤组织,增殖获得大量胚性愈伤组织,再分化形成不定芽,经生根和炼苗再生成完整植株,经SRAP分子标记检测遗传性一致,能为火龙果基因工程育种和种苗快速繁育提供新的途径。(3)通过HPLC-MS/MS法测定火龙果茎段鲜样及不同来源愈伤组织的脱落酸(ABA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米素(ZT)四个内源激素的含量,以期找到火龙果愈伤组织再分化率低的内源激素规律,为火龙果花药培养中合理添加外源激素提供一定的理论依据。结果表明:火龙果茎段易于诱导愈伤组织与其内源IAA和ZT含量较高关系密切。火龙果茎段鲜样中的GA3含量明显低于茎段或花药愈伤组织,ABA含量则高于茎段愈伤组织,小于花药愈伤组织。花药诱导的愈伤组织中IAA的含量明显低于茎段愈伤组织,而ABA的含量却高于茎段愈伤组织,花药愈伤组织的ABA/GA3、ABA/IAA的比例都明显高于茎段愈伤组织,其中未分化花药愈伤组织的ABA/GA3的比值是茎段愈伤的6.71倍、是可分化花药愈伤组织的3.82倍,ABA/IAA的比值是茎段愈伤的43.68倍、是可分化花药愈伤组织的16.02倍,不利于愈伤组织的再分化。由此表明,较高含量的ZT、IAA及较低的GA3/ZT比值有利于火龙果花药愈伤组织不定芽的分化,而高含量的GA3则会抑制不定芽分化。初步得出提高火龙果花药愈伤组织分化不定芽的方法,即在培养其中适当增加外源激素ZT和IAA的含量,减少GA3的添加量。(4)以火龙果花药培养获得的胚性愈伤组织为受体,采用农杆菌介导法转化抗寒LTP基因,开展了表达载体构建、菌液制备、Kan选择压的筛选、农杆菌浸染火龙果愈伤组织的方式及时间、共培养时间、选择培养基、抗性愈伤的PCR检测、不定芽诱导等研究。结果表明:成功构建了由CaMV35S启动子调控的LTP基因植物表达载体pCAMBIA 3301-LTP,并经根癌农杆菌LBA4404的感受态细胞进入菌体中;75mg/L的Kan浓度为火龙果花药愈伤组织适宜的选择压;花药愈伤组织的浸染适宜时间为8 min;共培养培养基为:MS + TDZ0.4mg/L+2,4-D0.5mg/L + NAA0.6mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L:选择培养基为:MS + TDZ0.4mg/L + 2,4-D0.5mg/L + NAA0.6mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂7.5 g/L + Kan 75 mg/L + Cef 375 mg/L。采用此转化体系进行遗传转化,最终得到106个Kan抗性愈伤组织块,随机提取5个抗性愈伤组织块DNA进行LTP基因的特异性扩增检测,结果显示5个抗性愈伤组织块均扩增出了预期目的条带,PCR检测的阳性率为100%。但后续抗性愈伤组织未成诱导出不定芽。初步建立了以火龙果愈伤组织为受体农杆菌介导的遗传转化体系,可为后续的转基因研究提供技术基础。(5)以火龙果无菌组培苗茎段为受体材料,采用农杆菌介导法转化抗寒LTP基因,开展了 Kan选择压的筛选、农杆菌侵染方式及时间、共培养时间、选择培养基、抗性芽PCR和southern杂交检测研究。结果表明:50mg/L的Kan浓度为火龙果茎段适宜的选择压;茎段的浸染时间为15min;共培养培养基为:MS + 6-BA2.0mg/L + NAA0.1mg/L +Tryptone 250 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L;选择培养基为:MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.1 mg/L + Tryptone 250 mg/L + 蔗糖 30 g/L + 琼脂 7.5 g/L + Kan 50 mg/L + Cef 375 mg/L。采用此转化体系进行遗传转化,最终得到63个Kan抗性芽,随机提取8个抗性芽DNA进行Bar基因的特异性扩增检测,结果显示有6个抗性芽扩增出了预期目的条带,PCR检测的阳性率为75.0%,进一步对8个抗性芽进行Southern杂交检测,结果有3个材料出现了明显的杂交信号,表明LTP基因已经成功导入火龙果受体中,转化率约为37.5%。后续对抗性芽进行生根、炼苗,获得25株再生植株。初步建立了以火龙果茎段为受体农杆菌介导的火龙果遗传转化体系。(6)对获得的转LTP基因再生植株进行形态观察及抗寒性相关分析,结果表明:同等低温条件下,转LTP基因的火龙果幼苗出现萎蔫及枝条转黄的状况都较对照明显减轻:在低温持续过程中,转LTP基因植株的REC、MDA含量呈逐渐增加的趋势,但显著低于对照;而Pro含量、SOD、POD、CAT酶活性呈先增加后降低的趋势,且明显高于对照。综合表型特征鉴定及抗寒性分析表明,转LTP基因植株较对照对低温的抵抗力明显增强,抗寒性显著提高。
【图文】：

火龙果,细胞学特征,双核期,小孢子

２．２不同发育时期火龙果小孢子细胞学特征变化逡逑跟以往大多数研究植物小孢子发育的结果相似，显微结构观察表明火龙果小孢逡逑子发育同样经历了四分体时期、单核早期、单核靠边期、双核期四个阶段（图２－２）。逡逑在形成四分体时，小孢子外包被着一层透明的肼胝质，在卡宝品红染色下清晰可见逡逑三个细胞，而另一个细胞由于轮廓不明显在背面不易观察到。随后细胞发育进入单逡逑核早期，此时细胞核位于中央，未观察到有明显的液泡。细胞发育至单核靠边期时，逡逑较单核早期相比，细胞体积逐渐增大，形成的中央大液泡将细胞核挤压到细胞的另逡逑一侧，且细胞壁上出现３条明显的萌发沟。最后细胞发育进入双核期，此时的花粉逡逑己发育成熟，大部分成熟的花粉粒为近圆形，同时形成了明显的二核花粉，即具有逡逑１个体积相对较大且靠近大液泡的营养细胞和１个体积相对较小且紧挨花粉壁的生逡逑殖细胞。逦，逡逑■■■■Ｉ逦＾邋ｌ逡逑、？逡逑Ａ逦Ｂ逦Ｃ逡逑Ｄ逦Ｅ逦Ｆ逡逑图２－２火龙果小孢子各发育阶段的细胞学特征逡逑注：Ａ

示意图,火龙果,花药培养,示意图

逦Ｄ邋ｒ邋Ｅ逡逑图２－３不同小孢子发育时期花蕾和花药的形态特征逡逑注：Ａ：四分体时期；Ｂ：单核早期；Ｃ：单核靠边期；Ｄ，Ｅ：双核期逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋ｆｌｏｗｅｒ邋ｂｕｄｓ邋ａｎｄ邋ａｎｔｈｅｒ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ逡逑ｓｔａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ！逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ａ：邋ｔｅｔｒａｄ邋ｓｔａｇｅ；邋Ｂ：邋ｅａｒｌｙ－ｕｎｉｎｕｃｌｅａｔｅ邋ｓｔａｇｅ；邋Ｃ：邋ｌａｔｅ－ｕｎｉｎｕｃｌｅａｔｅ邋ｓｔａｇｅ；邋Ｄ，邋Ｅ：邋ｂｉｎｕｃｌｅａｔｅ邋ｓｔａｇｅ逡逑因此，可以根据火龙果花蕾的形态、大小和花药发育天数，从而确定小孢子最逡逑佳培养时期对应的采样标准。逡逑２．３小孢子发育时期对花药培养诱导率的影响逦．逡逑将‘紫红龙’火龙果花蕾（图２－４Ａ）切开，取出花药（图２－４Ｂ）接种于预备培养逡逑基上（图２－４Ｃ），胚状体和愈伤组织诱导结果见表２－３。小孢子不同发育时期对愈逡逑伤组织诱导的影响差异较大，虽然各发育时期的小孢子都能诱导出一定频率的愈伤逡逑组织，但均未能诱导出胚状体，以小孢子发育处于单核靠边期愈伤组织的诱导率最逡逑高
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S667.9

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