三角梅转录组SSR分子标记开发与离体再生体系构建

发布时间：2020-05-07 11:56

【摘要】：为了明确三角梅转录组SSR总体特征、开发出适用于分子育种的SSR引物,筛选出和鉴定苞片差异表达基因,本实验采用Illumina测序平台对B.spectabilis cv‘Speciosa’不同发育时期的叶片、苞片,及初开期的花的转录组进行高通量测序。根据转录组测序结果,采用MISA分析'Speciosa'转录组SSR位点信息,利用Primer 3设计引物,并选择50对引物对6个不同种和杂交种三角梅进行可转移性与多样性分析。结果表明:在‘Speciosa’转录组中,共检测出79 210个SSR位点,分布于60 318条Unigene中,出现频率为44.91%。优势重复基序为单核苷酸、双核苷酸,分别占总SSR位点的76.37%和13.26%。A/T和AG/CT分别是单核苷酸、双核苷酸的优势重复基元,占总SSR重复类型的71.66%和6.77%。挑选的50对引物中,有42对引物可以扩增到清晰稳定的目标条带,有效扩增率为84.00%,不同品种间的平均可转移率为85.86%;其中33对引物具有多态性,平均He和PIC分别为0.5548和0.4603。为实现三角梅种质创新的目的,诱导足够的愈伤组织,在组培水平上诱导多倍体育种做铺垫,实验取B.glabra cv‘Singerpore Pink’、B.specto-peruviana cv‘Mrs Butt’的幼嫩茎段、叶片,B.glabra cv‘Formosa’、B.spectabis cv‘Speciosa’播种两周后长出的下胚轴和子叶,以MS为基本培养基,设计不同激素水平的培养基加以比较,筛选出愈伤组织长势良好的生长素和细胞分裂素的最优配比,用最适的培养基继续增殖以获得足够的愈伤组织。结果表明,三角梅茎段与下胚轴更适合作为外植体来诱导愈伤组织。其中,适宜‘Singerpore Pink’茎段愈伤组织的培养基为MS+NAA0.2mg/L+6-BA1.0mg/L,适宜‘Mrs Butt'的茎段愈伤组织的培养基为MS+NAA0.2mg/L+6-BA0.5-1.0mg/L;适宜'Formosa'下胚轴愈伤组织培养基为 MS+IBA 0.1mg/L+6-BA 2.Omg/L。尚未发现适宜'Speciosa'下胚轴愈伤组织的培养基。
【图文】：

流程图,测序,流程图,文库

诺禾致源科技股份有限公司进行转录组测序，以期明确遗传信息。逡逑２．１．２建库测序逡逑样品上机测序前需经过样品检验、建库、测序等环节，具体流程图见图２－１：逡逑ｆ邋Ｔｏｔａｌ邋品检测」逡逑ｎｉＲＮＡ富篥逡逑双链ｃＤＮＡ合成逡逑末端修复加Ａ和接头逡逑＿邋＿ｖ邋邋邋．．．＂邋邋以ｗ．＇．．邋邋邋逡逑片段选择和ＰＣＫ窜集逡逑逦逦逦逦；邋逦逦逦邋ｖ逡逑文库质量检测逡逑Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ逡逑图２－１测序流程图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋ｆｌｏｗｃｈａｒｔ逡逑２．１．３文库构建及库检逡逑样品检测合格后，先富集真核生物ｍＲＮＡ。随后将ｍＲＮＡ打断成短片段，以逡逑ｍＲＮＡ为模板，，合成并纯化双链ｃＤＮＡ。之后对ＰＣＲ产物进行扩增并纯化，以建立逡逑最终的文库。在文库成功构建之后，先使用Ｑｕｂｉｔ２．０进行初步定量，稀释文库至逡逑１．５ｎｇ／ｕｌ，随后使用Ａｇｉｌｅｎｔ邋２１００对文库的ｉｎｓｅｒｔ邋ｓｉｚｅ进行检测，检测结果符合预期后逡逑８逡逑

序列,生物信息,分析流程,测序

测序后获得大量数据信息，对获得的数据要进行生物信息分析，从而获得所需的数据逡逑信息，分析包括原始测序数据处理，测序数据质控，转录本拼接，功能注释等内容，逡逑具体信息分析流程见图２－２。逡逑Ｋ始n甲数指逡逑测＊数据圿■评估逡逑转录本拼接逡逑ＳＮＰ和ＩｎＤｅｌ分析逡逑功能分类注释逦Ｃｏｉｓｅｔ逡逑ＳＳＲ分析逡逑ＣＤＳ预测逦０考字列比对分析逡逑基因表达好}逡逑逦ｉ逦逡逑差异表达基因分析逡逑ＧＯ富集分析邋ＫＥＧＧ畜集分析逦ＰＰＩ分析逡逑图２－２生物信息分析流程逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｐｒｏｃｅｓｓ逡逑２．１．５．１测序数据质量评估逡逑利用ＣＡＳＡＶＡ碱基对Ｉｌｌｕｍｉｎａ下机后给出的原始图像数据文件进行识别分析后逡逑获得原始测序数据，原始测序数据以ＦＡＳＴＱ的文件格式存储；该测序单次运行能够逡逑产生数十亿级的ｒｅａｄｓ，由于原始测序数据量巨大，需要运用统计学的方法，对所测逡逑的序列进行统计和质量控制。逡逑测序数据质控主要包括三部分：１．测序错误率分布检查，从而提高数据的整体质逡逑量及可靠性；２．邋Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ含量分布检测以排除ＡＴ
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S685.99

【参考文献】