番茄APR基因在硫代谢通路中的功能及作用机制研究

发布时间：2020-05-09 10:19

【摘要】：硫是植物生命活动所需的大量营养素之一,是植物体内半胱氨酸(Cysteine,Cys)、H_2S、辅酶因子等重要含硫物质的组成部分。植物通过根部吸收的SO_4~(2-)被硫酸盐转运蛋白介导的质子/硫酸盐共转运,随后被运输到植物质体及叶绿体中,进行SO_4~(2-)的活化及同化途径。在硫酸盐同化途径中,腺苷5'-磷酰硫酸还原酶(Adenosine 5’-phosphosulfate reductase,APR)将活化后的APS还原为SO_3~(2-),SO_3~(2-)再被一系列的酶还原为Cys。目前研究表明APR为硫同化通路中的关键限速酶,高度控制着硫通量,但其在植物硫代谢中的具体功能及作用机制尚不清楚,因此,本研究通过对不同植物物种中APR家族成员进行生物信息学分析,以番茄为试验材料,利用病毒诱导基因沉默表达系统和CRISPR/Cas9基因编辑技术,同时采用同源重组技术构建APR超表达转基因番茄植株,研究APR基因在番茄硫代谢通路中的功能及作用机制,主要的研究结果如下:通过生物信息学鉴定包含番茄在内的50个已测序植物物种,共122个APR基因,其中番茄APR基因家族共3个成员(APR1、APR2、APR3),通过系统发育树、motif及内含子-外显子结构分析发现,番茄APR与马铃薯、甘薯、胡萝卜、多角螺旋藻、大叶藻这5种植物同源性较高;通过分析番茄与这5种植物的启动子作用元件,发现启动子序列均含有SURECOREATSULTR11,这是一个重要的调控硫转运的顺式作用元件;双荧光素酶报告系统结果表明,硫转运蛋白Sultr2可以结合在APR上游SURECOREATSULTR11启动子元件上来激活APR的表达。以Micro-tom番茄为材料,在缺硫胁迫处理下,发现APR1和APR3 mRNA表达水平显著上调;进一步对APR1和APR3进行组织特异性表达分析,结果表明,APR1和APR3在根、茎、叶、花、果实中均有不同程度表达,其中,在根和叶中的表达量最高,花和果中的表达量最低且相差不大,根中APR1、APR3表达量分别是花(果)的11倍、10倍,叶中APR1、APR3基因表达量分别是花(果)的7倍、6倍;对APR1和APR3进行番茄果实不同发育时期RT-qPCR分析的结果表明,在破色期APR1、APR3表达量最高,绿熟期表达量最低,破色期APR1、APR3基因表达量分别为绿熟期的8.5倍和10倍;为了研究APR1和APR3的亚细胞定位,本实验构建了APR1-GFP和APR3-GFP载体,用农杆菌介导的方法转化本氏烟草,通过共聚焦显微镜观察发现,APR1和APR3蛋白均定位在叶绿体中,结果表明硫同化途径主要在叶绿体中发生;为了初探APR1和APR3基因在硫代谢中的功能,本实验以Micro-tom番茄为材料,利用基因病毒沉默技术(VIGS),构建了APR1和APR3的病毒沉默载体,通过筛选鉴定得到APR1和APR3沉默植株,并分析Cysteine(Cys)在沉默植株与对照植株(TRV)中的表达情况,结果表明,APR1和APR3基因的沉默会导致植物体内Cys含量的下降,说明番茄APR1、APR3基因在硫代谢通路中控制着无机硫流向Cys的硫通量。为进一步鉴定APR在硫代谢通路中的功能及作用机制,本研究以Ailsa Craig番茄作为材料,利用CRISPR/Cas9技术,构建了APR1和APR3的Cas9载体,同时利用同源重组技术构建了番茄APR1和APR3的pBI221载体,利用农杆菌介导的方法侵染番茄叶片,通过筛选鉴定得到T1代番茄APR1基因编辑植株;对基因编辑植株中的APR上游基因ATPS、下游基因SiR的表达量进行了分析,结果显示,在APR1基因编辑植株中,APR上游ATPS基因表达显著上调,且表达量至少是WT的1.5倍,最高的是WT的4倍,而下游SiR基因表达量均下调,相较于WT至少下调了40%,最多的下调了近80%,结果表明,硫同化通路中ATPS、SiR基因的表达受到了APR的调控;采用吸收阱的方法测定番茄APR1基因编辑植株中内源H_2S含量,结果表明,番茄APR1基因编辑植株中的H_2S含量比WT植株低了近一半,进一步说明了番茄APR控制着硫同化通路中的硫通量。同时为研究APR基因在非生物胁迫中的作用,本实验以T1代番茄APR1基因编辑植株愈伤组织为材料,通过硒酸盐胁迫处理发现,相比于WT植株,番茄APR1基因编辑植株愈伤组织褐化更明显,表明番茄APR1基因编辑植株对硒酸盐更敏感。综上所述,番茄APR1-GFP和APR3-GFP定位在叶绿体中,表明番茄硫同化过程主要发生在叶绿体中;APR基因编辑导致下游基因SiR的下调,进一步导致硫代谢通路中H_2S、Cys含量的下降,说明APR基因在控制硫通量方面发挥着重要作用。
【图文】：

序列,植物,硫酸还原,磷酰

图 1. 1 植物硫代谢通路Fig 1.1. Sulfur metabolic pathway in plants磷酰硫酸还原酶（APR）研究现状’-磷酰硫酸还原酶（APR）的结构及蛋白亚细胞定位研究现状’-磷酰硫酸还原酶（Adenosine 5’-phosphosulfate reductase, AP路中的限速酶。据研究报道，在拟南芥中有 3 个 APR 亚型，其是 APR2[35,45]。通过蛋白结构域分析，APR 具有两个结构域，，移结构域（Thioredoxin），另一个是 APS 还原酶催化中心的氨（PAPS_reductase）。N-末端结构域构成 APR 的活性中心，域硫氧还蛋白将电子从 GSH 转移到 N-末端结构域[37-38]。尽管域的序列与硫氧还蛋白、谷氧还蛋白相比较，与硫氧化蛋白同的活性位点由两个邻位半胱氨酸残基组成，更像谷氧还蛋白，谷氧还蛋白，因此它具有谷氧还蛋白的功能[39]。APR 发挥作用骤：首先硫酸盐从 APS 转移到活性半胱氨酸残基上，通过 C

结构域,基序,大叶藻,番茄

合肥工业大学专业硕士研究生学位论文由进化树结果图 2.1 A 可以看出，番茄、马铃薯、甘薯、多角螺旋藻、大叶藻和胡萝卜的 APR 蛋白在系统发育树的同一个分支上，因此番茄 APR 基因家族与马铃薯、甘薯、多角螺旋藻、大叶藻和胡萝卜中 APR 基因同源性最高。通过 MEME 网站鉴定了植物 APR 基因的 10 个保守基序，各物种之间，相同的基序越多，功能越保守，由图 2.1 A 可知，番茄和这些植物物种基本上都含有这 10 个基序，表明 APR 基因功能在整个植物物种中是十分保守的。
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S641.2

【参考文献】