桃SnRK1蛋白激酶βγ亚基的克隆以及功能的分析

发布时间：2020-05-14 06:29

【摘要】：蔗糖非发酵-1-相关蛋白激酶-1(sucrose non-fermenting-1-related kinase1,SnRK1)是植物体内生理活动调控枢纽之一,参与调控植物代谢、发育以及胁迫应答等多个过程。SnRK1蛋白激酶是异源三复合物,是由催化亚基α和调节亚基β、γ或βγ组成。目前关于SnRK1βγ的研究主要是以拟南芥、玉米和苜蓿等草本植物为试材,而木本植物SnRK1βγ还未见其基因被克隆与鉴定的报道,其表达调控特征及在植物体内的生理功能尚不清楚。本文从毛桃中克隆到SnRK1βγ基因,并构建正义表达载体,成功转化拟南芥,初步研究PpSnRK1βγ基因的功能,主要结果如下:1.桃基因组中的ppa004800m和ppa004966m属于SnRK1βγ基因,本试验克隆PpSnRK1βγ1(ppa004800m)和PpSnRK1βγ2(ppa004966m),其cDNA分别为1476bp和1452bp,编码492和484个氨基酸残基。序列分析表明,PpSnRK1βγ1和PpSnRK1βγ2包含CBM和4个CBS结构域;系统进化树分析表明,PpSnRK1βγ1与果梅的SnRK1βγ蛋白亲缘关系最近,PpSnRK1βγ2与苹果SnRK1βγ亲缘关系最近。通过与其他物种的氨基酸序列进行比对,相似性达到79.40%。荧光定量PCR分析表明PpSnRK1βγ1和PpSnRK1βγ2基因在实生毛桃的根、茎、叶和‘鲁星’油桃的叶、花、果中均有表达,其中在‘鲁星’油桃的果实中表达量最高,在实生毛桃的茎中表达量最低。PpSnRK1βγ1和PpSnRK1βγ2基因在植物组织中不同部位的表达水平可能与其参与的植物生理过程有关,在植物不同组织器官,基因行使不同的功能。2.构建重组质粒p35S::PpSnRK1βγ1,并成功侵染拟南芥,获得超表达拟南芥株系A-βγ1。与野生型相比,超表达PpSnRK1βγ1拟南芥株系中SnRK1活性提高了77.13%。与野生型相比,超表达PpSnRK1βγ1基因拟南芥株系A-βγ1的花期比野生型约晚2.19d,莲座叶数量比野生型多1.17片/株;叶片的叶绿素、可溶性糖和可溶性蛋白含量均显著高于野生型拟南芥,分别比野生型提高了13.7%,12.9%和23.3%,但淀粉含量却没有显著性差异。因此,超表达PpSnRK1βγ1基因拟南芥株系A-βγ1将获得更长的生长期,获得较长的营养储藏时间。3.在0.1μmol·L~(-1)MV氧化胁迫条件下,超表达PpSnRK1βγ1拟南芥植株与野生型种子的萌发和根系生长均受到抑制,但前者具有较高的萌发率和较长的主根长;2~8μmol·L-1MV叶片喷施拟南芥植株叶片,超表达PpSnRK1βγ1拟南芥植株保留更多的绿色叶片。这说明从外在生物学表型上,超表达PpSnRK1βγ1拟南芥植株抗氧化能力更强。在2μmol·L-1MV喷施3h后,超表达PpSnRK1βγ1拟南芥植株丙二醛(MDA)含量比野生型低40.7%,四种抗氧化酶CAT、SOD、GSTs和POD酶活性均高于野生型植株,说明超表达PpSnRK1βγ1基因能提高拟南芥植株的抗氧化能力。在氧化胁迫条件下,超表达植株的SnRK1酶活性高于野生型植株,定量PCR结果显示,在超表达PpSnRK1βγ1拟南芥中,胁迫响应基因AtHSPRO1和AtHSPRO2的表达量也均较野生型植株明显升高。综上所述,PpSnRK1βγ在桃树生长过程中发挥重要的作用,不同组织器官中差异的表达量与其功能有关。超表达PpSnRK1βγ1拟南芥植株营养生长要明显的强于野生型植株,说明PpSnRK1βγ可能与植物糖代谢过程相关性明显;此外,本实验证实PpSnRK1βγ1基因进行超表达能够增强植株的抗氧化能力。
【图文】：

PpSnRK1βγ1(A)和PpSnRK1βγ2(B)编码蛋白质结构预测

桃SnRK1蛋白激酶βγ亚基的克隆以及功能的分析

PpSnRK1βγ1与其他物种SnRK1βγ氨基酸序列的系统进化树
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S662.1;Q943.2

【参考文献】