21种野生百合再生体系的建立及‘索邦’GA20ox表达分析

发布时间：2020-05-22 01:18

【摘要】：百合具有重要的观赏、食用和药用价值,其市场需求与发展前景十分广阔。我国虽然拥有丰富而宝贵的野生百合种质资源,但目前并未得到充分的保护和开发利用,缺乏系统的繁殖体系和具有自主知识产权的百合新品种。利用组织培养繁殖技术,不仅可以解决百合传统繁殖中的脱毒及退化问题,为百合现代化生产提供一条快速稳定的繁殖途径,更可为种质保存及基因工程研究奠定基础。株高作为影响百合切花品质和盆栽应用形式的一个重要因素,近年来逐渐受到育种工作者的关注。基因工程技术的发展,为百合株高育种提供了新的途径,分离验证与百合株高相关的基因是实现该目标的前提。本研究以我国21种野生百合及‘索邦’鳞茎为材料,对组培再生体系建立中灭菌方法、植物生长添加剂、外植体类型和培养条件等进行了研究,建立了野生百合高效快繁体系。另外,为研究百合株高调控机理,从‘索邦’叶片中分离出编码活性GAs合成过程中双加氧酶的基因GA20ox,并对该基因的表达模式进行了分析。主要结果如下:1.采用0.2%升汞对卷丹鳞片消毒的结果表明灭菌7 min效果最佳。参照卷丹鳞茎的幼嫩程度及其最佳升汞消毒时间,对其它百合的消毒时间进行试验,成功诱导了另外21种百合鳞片的再生,但文山百合、‘索邦’、宜昌百合和兰州百合等再生状况较差,表明根据鳞茎幼嫩程度确定的升汞消毒时间对成功诱导鳞片再生有一定的效果,但外植体再生状况的改善不能单纯依赖消毒时间的调整。2.卷丹鳞片最适不定芽诱导培养基为MS+1.0 mg·L~(-1) 6-BA+0.1 mg·L~(-1) NAA,诱导系数为2.09;最适愈伤组织诱导培养基为MS+1.5 mg·L~(-1) PIC,诱导率为86.66%。欧洲百合鳞片最适不定芽诱导培养基为MS+2.0 mg·L~(-1) 6-BA+0.1 mg·L~(-1) NAA,诱导系数为2.50;最适愈伤组织诱导培养基为MS+0.2 mg·L~(-1) TDZ+0.5 mg·L~(-1) NAA,诱导率为77.14%。采用三因素方差分析影响20种百合诱导再生的因素,结果表明6-BA浓度对百合再生能力的影响协同基因型和外植体类型差异而有所不同,并且不同百合再生能力差异较大,鳞片再生能力强于叶片。3.欧洲百合愈伤增殖适宜于暗培养;最适增殖培养基为MS+0.5 mg·L~(-1) 6-BA+0.1mg·L~(-1) NAA,增殖指数为2.93;分化适宜于暗培养,芽再生系数为5.43。泸定百合愈伤增殖适宜于光培养;最适增殖培养基为MS+1.0 mg·L~(-1) 6-BA+0.1 mg·L~(-1) NAA,增殖指数为3.10;分化适宜于光培养,芽再生系数为2.67。运用两因素方差分析影响11种百合愈伤增殖和分化的因素,表明基因型和光暗培养条件对愈伤增殖指数和分化系数存在交互作用和单因素主效应,并对愈伤和芽的生长状态产生不同的影响。4.已完成18种百合不定芽在培养基MS+0.1 mg·L~(-1) NAA+6%蔗糖的生根培养中,生根率均达100%,总体生根状况良好。鳞茎膨大效果差异较大,与鳞茎增殖个数显著负相关。完整无菌苗移栽成活率达90%以上,生长状况良好。5.利用RACE技术获得‘索邦’GA20ox的cDNA全长序列1 502 bp,开放阅读框为1 167 bp,编码388个氨基酸。‘索邦’GA20ox和其他物种的GA20ox蛋白有很高的相似性,均含有保守的PLN02276结构域,与姬蝴蝶兰和铁皮石斛等单子叶植物的GA20ox蛋白具有较高的同源性。6.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,‘索邦’GA20ox在各部位的表达与生长发育密切联系,具有一定的时空特异性。200 mg·L~(-1) GA_3对萌芽期‘索邦’的处理最有利于株高的增加,并在不同程度上抑制了GA20ox在多组织器官中的表达。推测GA20ox的表达受活性GAs的反馈调节,这种调节机制在维持体内活性GAs稳态中发挥重要的作用。
【图文】：

百合,不定芽,卷丹,欧洲

periodB1 √ 0.00 0.00 0.90±0.13d 0.00cB2 √ 0.50 0.10 2.07±0.25b 32.51±11.95abB3 √ 1.00 0.10 1.53±0.27c 26.97±8.96abB4 √ 2.00 0.10 2.50±0.37a 44.43±7.87aB5 √ 0.50 0.50 1.44±0.42c 16.68±11.77bcB6 √ 1.00 0.50 1.33±0.21c 22.22±12.40bB7 √ 2.00 0.50 0.71±0.07d 41.67±15.96aB8 √ 0.00 0.00 1.09±0.23c 0.00cB9 √ 0.50 0.20 1.46±0.25bc 77.14±7.00aB10 √ 0.50 0.60 1.57±0.26b 48.57±7.00bB11 √ 1.00 0.20 1.74±0.23ab 45.72±5.71bB12 √ 1.00 0.60 2.00±0.31a 68.57±14.00aB13 √ 0.00 0.00 1.09±0.23b 0.00dB14 √ 0.20 0.01 1.13±0.29ab 63.34±6.67abB15 √ 0.60 0.01 0.69±0.22c 66.67±7.03aB16 √ 0.20 0.10 1.49±0.26a 34.44±11.33cB17 √ 0.60 0.10 1.16±0.21ab 54.45±7.37b

泸定百合,百合,欧洲,愈伤

图 2-3 欧洲百合和泸定百合愈伤组织的增殖和分化) 在暗培养条件下增殖的欧洲百合愈伤；(B), (F) 在光培养条件下增殖的欧洲百合愈伤养条件下增殖的泸定百合愈伤；(D), (H) 在光培养条件下增殖的泸定百合愈伤；(I)-(M下欧洲百合体胚的发育过程；(N) 光培养条件下欧洲百合愈伤的再生；(O) 光培养条定百合愈伤组织分化的不定芽；(P) 暗培养条件泸定百合愈伤组织分化的不定芽Fig. 2-3 The callus proliferation and differentiation of L. martagon and L. sargentiaeE) Callus of L. martagon proliferation in the dark; (B), (F) Callus proliferation of L. martago-h light/dark photoperiod; (C), (G) Callus of L. sargentiae proliferation in the dark; (D), (H) liferation of L. sargentiae under 16/8-h light/dark photoperiod; (I)-(M) Developmental proceatic embryos generated from callus of L. martagon cultured in the dark; (N) Embryo-like struned from callus of L. martagon under 16/8-h light/dark photoperiod; (O) Callus differentiatiogentiae under 16/8-h light/dark photoperiod; (P) Callus differentiation of L. sargentiae in the2 光暗培养条件对欧洲百合和泸定百合愈伤组织分化的影响欧洲百合和泸定百合的愈伤组织接种于 MS 培养基，，分别置于光培养和暗
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S682.29

【参考文献】