NACs在豆梨种子发育和休眠解除过程中的作用研究及应用

发布时间：2020-05-24 05:54

【摘要】：种子是多数植物生命周期的开始。多年生木本植物种子往往存在休眠现象,以保证种子在适宜的时间、适宜的环境萌发。梨种子就存在休眠现象。目前关于梨种子休眠形成的分子机制还不清楚。NAC是植物特有的转录因子,参与植物种子发育、次生细胞壁生长、果实成熟等多个生理过程。但其在种子休眠解除中的作用还未见报道。本论文以梨砧木豆梨种子为试验材料,测定了豆梨种子发育过程中糖类物质(葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉)和激素(GA和ABA)的变化情况,及休眠解除过程中活性氧及其代谢相关酶和激素(GA和ABA)变化情况,并利用反义寡聚核苷酸技术研究NAC转录因子在豆梨种子休眠解除中的作用机制,主要结果如下:1、确定9个NAC基因结构特点。以参与豆梨种子休眠解除的miRNA164靶基因—9个NAC转录因子为对象,利用生物信息学方法,发现9个NAC基因所编码的蛋白质含有290-362个氨基酸,蛋白质分子量约为32604.7-40415.6 Da,等电点为6.1775-8.3422。其中PpNAC5、PpNAC134、PpNAC86、PpNAC42、PpNAC121、PpNAC34 和PpNAC138 为碱性氨基酸,PpNAC65和PpNAC145为酸性氨基酸。蛋白质疏水性数值显示只有PpNAC86是两性氨基酸,其余8个NAC都是极性氨基酸。系统分类和功能预测表明,9个NAC蛋白属于第Ⅱ类,PpNAC34和PpNAC138归类于NAC1亚组,介导激素信号通路;其余NAC归类于NAM亚组,其中PpNAC5、PpNAC134、PpNAC86可能与种子胚胎发育及萌发有关。2、确定豆梨种子在发育过程中的糖类物质和激素的含量变化,以及该过程中NAC基因表达情况。在整个豆梨种子发育过程中,葡萄糖含量先大幅度降低随后保持平稳,而蔗糖含量先大幅度增加随后趋于稳定,淀粉含量前期平稳后期大幅度增加。ABA含量逐渐增加,而GA含量表现出降低—平稳—降低的趋势变化。综合NAC表达情况,其中PpNAC65下调趋势与GA类似,PpNAC34和PpNAC138的上调趋势与ABA相似,暗示PpNAC34、PpNAC65和PpNAC138可能与豆梨种子发育进程有关。3、确定豆梨种子在休眠解除过程中的NAC基因表达情况,进一步确认PpNAC5、PpNAC65和PpNAC138在豆梨种子休眠解除过程中的作用。利用反义寡聚核苷酸技术分别抑制豆梨种子中相关NAC基因的表达。研究发现,与正常层积的种子相比,抑制处理的种子不同程度提前萌发。当PpNAC表达被抑制,GA含量和ROS含量及其合成相关基因表达被显著诱导;当PpNAC65表达被抑制,GA含量及其合成相关基因表达量显著增加;当PpNAC138表达被抑制,ABA含量及其合成相关基因表达量显著降低,而GA含量及其合成基因表达量显著提高。推测PpNAC5可能通过参与GA和ROS合成途径,PpNAC65通过调控GA合成途径,而PpNAC138则参与GA和ABA合成途径,从而调控豆梨种子休眠解除过程。通过上述研究,初步提供了NAC转录因子参与豆梨种子发育与休眠解除相关生理过程的证据。研究结果丰富了NAC基因家族成员在梨种子发育及休眠过程中的功能,也为生产上建立快速打破种子休眠,培养优质高效生长梨种苗提供理论依据。
【图文】：

ＮＡＣ转录因子的主要特征是包含ＮＡＣ结构域。典型的ＮＡＣ蛋白质Ｎ端含有１５０逡逑多个高度保守的氨基酸残基组成的ＮＡＣ结构域，Ｃ端含有一个高度多样化的转录调控逡逑（ＴＲ）结构域（图１－ｌａ）邋［４８］。ＮＡＣ结构域根据多重序列联配的结果可被划分为高度保逡逑守的Ａ、Ｃ、Ｄ和保守性较低的Ｂ、Ｅ这５个亚结构域。其中，亚结构域Ｃ和Ｄ可能与逡逑结合ＤＮＡ有关，Ａ可能参与同源和异源二聚体化，Ｂ、Ｅ可能与ＮＡＣ蛋白质功能的多逡逑样化有关，并协同Ｄ与ＤＮＡ发生相互作用［４９］。一些ＮＡＣ还存在保守的锌指（ＺＦ）结逡逑构（图卜ｌｂ），邋ＺＦ是由保守氨基酸的小基团与锌离子结合形成类似手指状的ＤＮＡ结合逡逑结构域，其结合结构域是ＮＡＣ与ＤＮＡ结合蛋白的一个保守基序。比如况４0？５０结合逡逑（Ｃ／Ｔ）邋Ａ邋（Ｃ／Ａ）邋Ｇ邋基序，Ｍ４Ｃ０７９、似（：０５５邋和}0＜：０７２邋结合邋ＣＡＣＧ邋基序／６Ｍ４Ｃ７逡逑结合甘薯贮藏蛋白启动子中创伤反应顺式作用元件（ＳＷＲＥ）区域的特定基序是逡逑ＴＡＣＡＡＴＡＴＣ［５１］，ｒＵＣＭ吏用ＣＡ邋（Ｔ／Ａ）邋Ｇ共有序列来调节靶基因［５２］。对于拟南芥１０８逡逑个ＮＡＣＴＦｓ

孙娅ＮＡＣｓ在豆梨种子发育和休眠解除过程中的作用研究及应用逦＾逡逑基酸序列，但是其氨基酸序列组成和长度的差异性均会导致它们基因功能不同。因此逡逑ＮＡＣ基因的生物学功能越相近，其保守结构域的同源性越高。逡逑２．３梨ＮＡＣ转录因子保守元件分析逡逑利用ＭＥＭＥ预测保守的Ｍｏｔｉｆｓ，进一步分析９个梨ＮＡＣ蛋白质的多样性（图２－３）。逡逑根据得到的模序预测结果分析发现，这９个ＮＡＣ蛋白序列皆包含保守元件ｍｏｔｉｆ邋１、ｍｏｔｉｆ逡逑２、ｍｏｔｉｆ４、ｍｏｔｉｆ邋５、ｍｏｔｉｆ邋８和ｍｏｔｉｆ邋９，且同源关系较近的蛋白质有相似的ｍｏｔｉｆｓ组成。逡逑除了共有的保守元件，聚在同一亚族的和都额外包含ｍｏｔｉｆｌ８，同逡逑源关系相近的逦也都额外包含了邋ｍｏｔｉｆ６、ｍｏｔｉｆ７、ｍｏｔｉｆ邋１５、逡逑ｍｏｔｉｆ邋１７，这可能就是导致它们在功能上存在差异的原因。这２０邋ｔｍｏｔｉｆ的序列长度在逡逑６？５０之间（表２－２）。逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S661.2

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本文编号：2678557