魔芋转基因体系的研究以及中性神经酰胺酶基因的克隆

发布时间：2020-05-28 22:01

【摘要】：魔芋系天南星科(Araceae),魔芋属(Amorphophallus)植物的总称,它是一种多年生草本植物。在中国,魔芋资源丰富,具有悠久的栽培历史,在21个魔芋种中有11个种可以食用,其中6个种已有栽培。因其块茎中含有大量的葡苷聚糖(glucomanna)和生物碱等物质而在食品、医药、化工中具有广泛应用,具有较高开发利用价值。有关魔芋组织培养的研究在上个世纪80年代就早有报道,但因魔芋为单叶柄支撑的单复叶植物通常用地下根状茎无性繁殖,其繁殖系数非常低再加上种芋根茎细嫩不能长距离运输,使得魔芋繁殖一直阻碍着其的大面积发展,优良品种推广速度慢。目前,关于魔芋的生物学特性研究以及其块茎中富含的葡甘聚糖的提取加工研究较多,但对魔芋块茎中他有效成分(如神经酰胺)及其代谢途径研究甚少。本研究不仅对魔芋组织培养中不同类型的愈伤组织进行了研究,还利用高通量测序(RNA-seq)技术对魔芋进行转录组测序,并将其数据进行分析,获得蛋白质功能注释、GO功能分析、KEGG代谢途径等数据。在此基础上筛选到了神经酰胺代谢途径上的关键基因-中性神经酰胺酶基因(NCase),对其进行了克隆以及初步功能验证。研究结果如下:利用白魔芋(A.albus)的雌蕊花序以及雄蕊为外植体,得到了5种不同类型的愈伤组织,对比了胚性愈伤非胚性愈伤组织之间的差别,并对魔芋胚性愈伤组织的发育过程进行了组织切片观察,从中找到了胚性愈伤组织具有发育各个时期典型特点的组织结构。此外本研究还探讨了最佳的外植体愈伤组织诱导培养基,分化培养基的激素种类及配比以及其pH值;培养的光照、温度等。优化组合得到白魔芋愈伤组织最佳诱导培养基:MS+1 mg/L NAA+2 mg/L 2,4-D+3 mg/L 6-BA,30g/L蔗糖,2g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP),白愈伤组织最适合的分化培养基为:MS+1 mg/L NAA+1 mg/L GA3+2 mg/L 6-BA,30g/L 蔗糖,2g/L PVP。白魔芋愈伤组织的诱导率最高可达到98.9%,分化率达到83.7%。农杆菌介导的白魔芋转基因。在前面建立的胚性愈伤组织的快繁体系的基础上,通过预培养、共培养筛选得到阳性愈伤组织,以Plasmid pCAMBIA1300为表达载体,将抗虫基因Cry2A基因转入到魔芋胚性愈伤组织中。提取再生植株叶片基因组并对其进行PCR检测,初步证明外源基因已转入到再生植株中,在实验得到的6株再生植株中有两株再生植株基因组中能检测到Cry2A外源基因的成功转入。利用Illumina HiSeq 2500高通量测序对弥勒魔芋(Amorphophallus muelleri)转录组进行了分析,获得弥勒魔芋15,867,314原始读序,数据量4.76G。除去含有带接头的、低质量的原始读序,对原始数据过滤,得到15132167个读序,数据量为4.54G。通过高级分析,给出所有all-unigene在样品中的表达量信息和功能注释信息,功能注释信息包括KOG功能注释和GO功能注释、Pathway注释,揭示了弥勒魔芋叶片中基因的表达状况。从转录组数据中我们分析得到弥勒魔芋经酰胺的代谢途径及代谢途径中相关的13个酶。我们选择了起到中枢调节作用的中性神经酰胺酶(neutral ceramidase)作为研究对象。首先我们通过RACE的方法,克隆得到了弥勒魔芋中性神经酰胺酶(NCase)的基因序列,为了进一步验证NCase的功能,我们将其转入到人工进行基因敲除的酵母,人工敲除酿酒酵母中神经酰胺酶基因YPC1p和YDC1p,排除酵母本身的干扰后,将得到的魔芋中性神经酰胺酶基因转入双缺型酵母中,通过Western blot检测到不同时期神经酰胺酶表达量的不同。以C12-NBD神经酰胺将作为底物,在体外一定条件下反应,通过高效液相色谱仪(HPLC)的检测,我们发现魔芋NCase能够分解Cl 2-NBD神经酰胺。本研究首次探索了弥勒魔芋神经酰胺酶与各种干扰素通路中相关基因的相互作用,发现魔芋中性神经酰胺酶能促进IFNα IFNβ,ISRE以及IL29的表达,NCase能够直接引起相关干扰素的基因的上调,而干扰素刺激会引起下游干扰素诱导基因(IFN stimulated genes,ISGs)表达变化,从而起到抗病毒的作用,研究还发现魔芋中性神经酰胺酶能对EV71病毒产生抑制作用,揭示了弥勒魔芋其在抗病毒方面的巨大潜力。
【图文】：

组织的再生体系研究还很少，而且诱导以及分化效率不高。本研究用白魔两种外植体为材料成功高效的诱导出胚性愈伤组织，并在此基础之上建立于白魔芋胚性愈伤组织的转基因再生体系，成功将基因转入到了白中。逡逑２．１材料与方法逡逑２．１．１实验材料逡逑材料来自于湖北恩施的白魔宇，，魔芋球莲顶有花芽。保存于温度在２８－３２度室内备用。逡逑大肠杆

本文编号：2685904