血叶兰快繁体系优化及促生内生真菌筛选

发布时间：2020-05-29 04:44

【摘要】：兰科(Orchidaceae)植物是一类重要的植物资源,具有较大的观赏价值和药用价值,市场需求大。由于自然状态下,兰科植物种子萌发困难,繁殖系数较低,采用组培技术虽可实现大量繁殖,但组培苗移栽驯化存活率低、生长发育缓慢,其重要原因在于其生命过程离不开共生菌的参与,因此研究菌苗共生对兰科植物的繁殖和保育具有重要的意义。血叶兰(Ludisia discolor)为海南传统黎药,具有独特的观赏价值和药用价值。由于其本身复杂的繁育系统及人为采伐导致的生境破坏,造成野生血叶兰极度匮乏。因此,本文以血叶兰为研究对象,对血叶兰种子进行非共生萌发,从而优化快速繁殖体系;并对野生血叶兰进行内生真菌的分离,探讨其内生真菌群落组成;将组培苗与分离到的内生真菌进行共生培养,从而筛选出具有促进作用的内生真菌,为血叶兰种苗的快速繁育与生产提供有价值的理论依据,对血叶兰种质资源繁殖保育具有重要意义。主要结果如下:1、血叶兰快繁体系优化(1)在非共生萌发的试验中发现,血叶兰最佳萌发培养基为KC+土豆20 g/L时,萌动时间最早,且萌发率高达88.44%;(2)对根状茎进行诱导分化,最佳诱导培养基为添加花宝4号的为培养基,其分化芽率98.30%,且萌发整齐、健壮;(3)以不同浓度的KT和NAA对血叶兰进行增殖,最佳增殖培养基为3.0mg/L KT+0.3mg/L NAA为,其增殖倍数为5.05倍,且增殖芽长势较佳;(4)在壮苗生根培养中,添加0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+10g/L 香蕉有利于增加血叶兰株高;0.5mg/L IBA+0.1mg/L NAA+100g/L香蕉有利于血叶兰生根培养基,综合最优组合还是0.5mg/L IBA+0.1mg/L NAA+100g/L香蕉,平均株高8.97 cm,平均生根数大3.59条;(5)最佳炼苗移栽基质为水苔,移栽成活率达到100%,且植株健康。2、血叶兰内生真菌多样性以野生血叶兰为研究材料进行内生真菌分离,获得66株内生真菌,经分子生物学鉴定,归为2目4纲18属,显示了血叶兰内生真菌的多样性,其中以刺盘孢属(Collettotrichum)为优势类群,占菌株总数33.33%;其次是曲霉属(Asoergillus)真菌,同时也分离到镰刀菌属(Fusariium)和链格孢属(Alternaria)。血叶兰不同部位内生真菌的分离率,以茎部的分离频率最高,为36.26%;叶片次之,为34.85%;根部最低,为28.79%,其中根部与茎段都以刺盘孢属(Colletotrichum)最多,分别占菌株总数36.84%与50.00%。不同组织中,叶的多样性指数和均匀度指数最高,分别为2.75和1.19;相似性系数为0.381,根与叶部位内生真菌的相似性系数最低,为0.267,但都表现为中等程度不相似。3、共生真菌筛选获得6株菌株能与血叶兰组培苗共生并起到促生作用,血叶兰与G9菌株共培养90d后,其平均鲜重增加率55.01%、株高8.76cm、茎粗0.48mm、生根数3.60条;其中G6菌株促进生根数最多4.40条,G11菌株(3.94 cm)则对根长起到促进作用。其中G6 菌株属于 Alternaria sp.,G9 与 Y21 菌株属于Colletotrichum sp.,G11 与 Y20 菌株属Daldinia sp.,Y6菌株属于Trichoderma sp.,可看出同一属不同种菌株对血叶兰起到的作用不同。
【图文】：

叶兰,蒴果,种子活力,视野

浸入７５％的无水乙醇３０ｓ，用无菌水冲洗２次，再用１％的次氯酸钠消毒５ｍｉｍ逡逑再用无菌水冲洗３次，风干水分，以上整个消毒过程均在洁净工作台进行，播种的同逡逑时取出一部分种子检查其含胚率和其活力（图２－１）。逡逑ｇｌＷＳＨ逡逑图２－１血叶兰蒴果（Ａ）；邋—个视野血叶兰种子活力（Ｂ＞逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｃａｐｓｕｌｅ邋（Ａ）邋ａｎｄ邋ｓｅｅｄ邋ｖｉｇｏｒ邋ｏｆ邋Ｌｕｄｉｓｉａ邋ｄｉｓｃｏｌｏｒ逡逑２．１．３．２培养及选择逡逑选用花宝１号、ＫＣ和１／２ＭＳ为基本培养基，附加土豆汁和椰汁，各种培养基均逡逑含８ｇ／Ｌ琼脂、２０ｇ／Ｌ蔗糖和ｌｇ／Ｌ活性炭，ｐＨ５．８？６．０（表２－２）。用解剖刀切开消毒处理逡逑后的血叶兰蒴果，将粉末状种子均匀散落到培养基上。将血叶兰均匀撒在培养基表面，逡逑种植密度适宜。为方便统计萌发率，每个处理１个蒴果，每个处理３个重复。暗培养逡逑７ｄ后，再进行光照培养。逡逑表２－２血叶兰无菌播种培养基逡逑Ｔａｂｌｅ２－２邋Ａｓｅｐｔｉｃ邋ｓｅｅｄｉｎｇ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｏｆ邋Ｌｕｄｉｓｉａ邋ｄｉｓｃｏｌｏｒ逡逑处理逦基本培养基逦有机添加物逦其他培养条件￣逡逑Ｎｏ．逦Ｂａｓｉｃ邋ｍｅｄｉｕｍ逦Ｏｒｇａｎｉｃ邋ａｄｄｉｔｉｖｅ逦ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ逡逑１逦ＫＣ逡逑２逦ｌｇ／Ｌ花宝１号逦２０ｇ／Ｌ邋土墜逡逑３逦１／２ＭＳ逦２０ｇ／Ｌ邋蔗糖＋８ｇ／Ｌ逡逑４逦琼脂＋ｌｇ／Ｌ活性炭逡逑ｌＯＯｍＬ逡逑５逦ｌｇ／Ｌ花宝１号逦±逦，逡逑椰汁逡逑６逦１／２ＭＳ逡逑１０逡逑

叶兰,根状茎

逑，□６１逡逑ａｎａ逡逑图３－１血叶兰种子萌发动态（Ａ、Ｂ：种胚膨大＝萌发；；Ｃ、Ｄ、Ｅ：种胚继续变大，种皮破裂，出逡逑现假根；Ｆ部分出现原生分生组织）逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｓｅｅｄ邋ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｄｙｎａｍｉｃ邋ｏｆ邋Ｌｕｄｉｓｉａ邋ｄｓｃｏｌｏｒ邋（Ａ－Ｂ：邋ｅｍｂｒｙｏ邋ｓｗｏｌｌｅｎ邋＝邋ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ；邋Ｃ－Ｅ：逡逑ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ邋ｅｍｂｒｙｏ邋ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ，邋ｔｅｓｔａ邋ｒｕｐｔｕｒｅｄ，，邋ｒｈｉｚｏｉｄｓ邋ｐｒｅｓｅｎｔ；邋Ｆ：邋Ａｐｐｅａｒａｎｃｅ邋ｏｆ逡逑ｐｒｏｔｏｍｅｒｉｓｔｅｍ）逡逑３．１．２花宝对血叶兰根状茎分化的影响逡逑不同花宝对血叶兰根状茎生长具有一定影响，将通过无菌萌发的根状茎转到花宝逡逑培养基上，其表面长满丰富的根毛状物（见图３－２），可能与培养基的湿度有关，经ｌ0ｄ逡逑左右的培养后，在根状茎顶端可以观察到陆续分化出的芽点，不同花宝对血叶兰根状逡逑茎生长发芽具有一定影响，试验结果表明（如表３－２），最适合血叶兰根状茎分化的培逡逑养基是花宝４号培养基，其诱芽率（９８．３０％）显著高于其他处理（Ｐ＜０．０５），其次是花宝１逡逑号培养基，其诱芽率８４．８６％；但从生长状况看，血叶兰根状茎在花宝１号与花宝４逡逑号的生长势没有显著差别
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S682.31

【参考文献】