番茄R2R3MYB转录因子家族鉴定及SlMYB41和SlMYB64基因功能研究

发布时间：2020-06-05 23:21

【摘要】：番茄(Solanum lycopersicum L.)是世界性的蔬菜,而且是重要的模式植物之一。在番茄的生长过程中,生物和非生物胁迫等严重影响番茄的产量和品质。R2R3MYB转录因子亚家族是MYB转录因子家族中数目最多的一类,广泛参与了植物的生长发育、次生代谢产物合成和胁迫应答。目前,在番茄中仅有少数的R2R3MYB转录因子被克隆和鉴定功能,而番茄基因组测序的完成,为利用反向遗传学进行基因功能的研究提供了有利条件。本研究在番茄基因组中鉴定得到121个R2R3MYB转录因子,并对其进行系统的生物信息学分析,筛选出可能响应非生物胁迫的51个基因,通过分析这些基因在非生物胁迫条件下的表达变化,进一步筛选出2个相关基因进行功能验证。主要研究结果如下:1、利用拟南芥126个R2R3MYB转录因子进行BlastP同源比对,在番茄基因组中鉴定出121个R2R3MYB转录因子,并对其进行N端R2和R3保守域的保守性分析、基因结构的特征分析、与其他物种的进化关系分析以及基因在染色体上的定位分析。2、利用进化关系结合已知的同源基因功能注释,在番茄121个R2R3MYB转录因子中筛选出51个可能响应非生物胁迫的基因,在非生物胁迫处理下检测这些基因的表达量变化,其中有10个基因响应NaCl处理,11个基因响应ABA处理,14个基因响应低温4℃处理,说明番茄R2R3MYB转录因子可能在植物的非生物胁迫响应中发挥重要的作用。对51个R2R3MYB基因进行组织表达特异性分析发现它们的表达存在组织表达特异性和表达模式多样性,据此推测番茄R2R3MYB转录因子参与调控不同组织的生长发育和代谢进程。3、对克隆得到的非生物胁迫响应基因SlMYB41构建过表达载体,利用番茄遗传转化得到转基因株系,表型分析结果表明过表达SlMYB41影响植株的正常生长,具体表现为植株变矮、叶面积减小、种子变小。4、为进一步探究SlMYB41基因的功能,分别取幼苗时期的35S:SlMYB41转基因株系和野生型植株进行转录组测序。差异表达基因分析结果显示,在SlMYB41过表达株系中,许多与胁迫响应相关的基因表达量显著上调,说明过表达SlMYB41可能影响番茄的抗性。抗旱试验结果显示,SlMYB41过表达株系耐旱性显著高于野生型株系。5、以SlMYB41基因的启动子为诱饵进行酵母单杂交筛库,筛选得到一个番茄ERF转录因子,与拟南芥ERF105同源;酵母单杂交验证结果显示SlERF105能够结合SlMYB41基因的启动子。构建酵母质粒pGBKT7-SlMYB41转入酵母菌株AH109中,结果显示SlMYB41具有明显的自激活活性,进一步研究发现SlMYB41的自激活活性区域在269-334aa之间。6、为验证SlMYB64的基因功能,对SlMYB64及其已知功能的同源基因进行进化关系分析,并将基因功能进行分类,对比发现SlMYB64在花粉发育方面的功能是该亚群的一个新功能。7、对SlMYB64过表达株系在幼苗期和开花期进行表型分析,发现过表达株系植株高度降低、主根变短、叶面积减小,说明SlMYB64可能负调控番茄的生长发育。8、为进一步验证SlMYB64在花粉发育方面的功能,本研究用半薄切片方法观察SlMYB64过表达株系和对照株系花药不同发育时期的形态结构,发现35S:SlMYB64株系绒毡层发育和退化以及花粉小孢子的发育出现异常。荧光定量PCR检测显示随着花药的发育SlMYB64基因表达量逐渐降低,而在过表达株系中SlMYB64表达量在花药发育的每个时期都过量表达6倍以上。花粉体内萌发试验证明SlMYB64只影响番茄的雄性育性。9、分别取SlMYB64过表达株系和非转基因株系第13时期的花药进行转录组分析,GO富集分析显示与花粉壁发育相关基因显著富集,说明SlMYB64直接或者间接参与花粉壁的形成。与番茄ms10~(35)(sldyt1)雄性不育突变体转录组差异基因进行比较,发现有26个共同差异表达基因,说明它们共同参与番茄花药发育。酵母双杂交验证结果显示SlMYB64与SlDYT1蛋白不能直接发生互作,说明SlMYB64与SlDYT1通过不同的调控路径共同参与调控番茄的雄性育性。
【图文】：

植物,绒毡层,小孢子,雄配子体

番茄 R2R3MYB 转录因子家族鉴定及 SlMYB41 和 SlMYB64 基因功能研究数分裂形成单核小孢子；第二个阶段是雄配子体的发生，减数分裂形成的育成成熟的花粉（图 1-2）。这些过程除了受到基因的调控之外同时也受到响（McCormick, 2004）。发育中的花药包含中间的减数分裂细胞（也称为）和四周围绕的花药壁。花药壁分为四层，从外到内依次是表皮层、内层毡层（图 1-3）（Li et al., 2011）。绒毡层在小孢子细胞的发育中起到非常重仅分泌胼胝质酶，分解包裹四分体的胼胝质，释放出小孢子，而且也能为提供必需的营养物质，包括糖类、脂质、蛋白质、花粉外壁合成前体物质四分体细胞分解释放后到雄配子体有丝分裂之前，绒毡层进行细胞程序性，而绒毡层细胞 PCD 的提前或者滞后，以及绒毡层的形态和结构出现异常孢子的发育成熟，以致影响花粉的育性（Ku et al., 2003; Varnier et al., 2005;）。

植物,转录因子,花药,受体蛋白激酶

图 1-3 植物花药的结构（Bedinger. 1992）Fig. 1-3 The structure of anther in plant个 MADS-box 类型的转录因子，，能够直接结合 SPL/NZZ 基因的启动子，调节基因的表达，在花药的早期发育过程中起重要的作用（Ito et al., 2004）。在花早期，也有一些蛋白激酶能够决定花药细胞的命运。如拟南芥 EXS/EMS1 基因富含亮氨酸重复序列的受体蛋白激酶，其突变体产生过多的小孢子母细胞、缺细胞，表现为完全的雄性不育（Canales et al., 2002; Zhao et al., 2002）。除此之南芥中另外两个富含亮氨酸重复序列的受体蛋白激酶基因BAM1和BAM2能与形成调控环，抑制 SPL/NZZ 在花药中的表达，同时也受 SPL/NZZ 的调控，参早期发育（Hord et al., 2006; Feng et al., 2010）。近期研究表明，许多编码转录因子的基因参与绒毡层的发育和 PCD。在拟DYSFUNCTIONAL TAPETUM1（DYT1）（Zhang et al., 2006; Feng et al., 2012）和 AMICROSPORES（AMS）（Sorensen et al., 2003; Xu et al., 2010, 2014; Ferguson et
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2;S641.2

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