‘云香’水仙NAC转录因子的克隆及抗逆功能分析

发布时间：2020-06-09 14:09

【摘要】：NAC转录因子(NAM、ATAF1/2、CUC2)广泛存在于植物中,除参与植物生长发育外,还在抵御生物和非生物胁迫中发挥重要作用,并已用于基因工程来改善植物的胁迫耐受性。中国水仙为冬季主要观赏花卉之一,其产量和品质在程度一定上受外界环境因子影响。目前对中国水仙NAC转录因子在逆境胁迫下的调节作用知之甚少,因此克隆和鉴定优良非生物胁迫相关NAC转录因子具有重要意义。本研究选用多花水仙新品种‘云香’为材料,基于其花期转录组数据信息,以RT-PCR技术克隆得到2个NtNAC(NtNAC1和NtNAC2)基因,并通过qRT-PCR技术分析了两个基因的时空表达模式以及在逆境和逆境相关激素处理下的表达变化,结合分析过表达转基因烟草植株在干旱和高盐胁迫下的表现等解析了两个基因的功能。主要的研究结果如下:NtNAC1基因全长1 083 bp,其ORF为918 bp,编码306个氨基酸,N端含有NAM保守结构域,聚分在SNAC1亚组,与香蕉MusaSNAC1、小麦TaNAC47亲缘关系较近。实时荧光定量分析显示,NtNAC1表达水平随花器官花瓣和副冠的发育呈先上升后下降趋势,始花期达到峰值;NtNAC1在根和叶中高表达,受ABA、MeJA、SA、H_2O_2、NaCl、PEG诱导上调,推测该基因可能参与‘云香’水仙花器官的形态建成及响应非生物胁迫。进一步构建表达载体转化烟草,获得9株转基因植株。在高盐和干旱胁迫处理下,转基因植株根系发达、长势更好、存活率高。此外,过表达转基因株系中抗逆相关基因P5CS、APX上调表达、SOD、POD酶活性提高及MDA的含量下降,减轻了胁迫造成的细胞膜损伤。NtNAC2基因的开放阅读框为936 bp,编码312个氨基酸。生物信息学分析显示,NtNAC2基因在N端含有NAM保守结构域,与单子叶植物芦笋、番红花和石斛等具有较近的进化关系。实时荧光定量检测显示,花瓣和副冠中NtNAC2基因的表达量随花器官发育逐渐上升,衰败期达到峰值;在ABA、MeJA、SA、H_2O_2、50℃、NaCl和PEG胁迫处理下,水仙根和叶中NtNAC2基因的表达量上调,且表现出时空表达特异性。为进一步鉴定其功能,构建植物表达载体转化烟草,获得10株转基因烟草,经半定量RT-PCR检测NtNAC2基因在转基因植株中过表达。高盐和干旱胁迫处理后,过表达转基因植株根长为野生型的2~3倍,叶片失水率低于30%,存活率高于60%,抗逆相关基因P5CS、APX的转录水平上升,MDA的积累更少,SOD和POD酶活性更高。综上所述,‘云香’水仙NtNAC1和NtNAC2过表达能提高烟草对高盐、干旱的耐受性,在抗逆中起正向调控作用,可作为提高水仙抗性的优良遗传基因资源,用于培育水仙抗性新品种。
【图文】：

转录因子,典型结构

N 端有约 40 个氨基酸组成的延伸区域（NTE），电离辐射处理调控辐射损伤响应蛋白激酶 ATM、ATR 通路[24]。此外，还有部典型结构相反，保守结构域位于 C 端，TRR 位于 N 端，两者之锌指结构（ZF），类似于维管植物拟南芥 AtVOZ1 和 AtVOZ2[24着生物信息学技术的发展，NAC 转录因子 N 端结构域的二、三Ernst 等[26]采用 X 射线结晶学方法研究双子叶植物拟南芥 ANAC构，这是 NAC 转录因子家族第一个确定蛋白结构的成员，该蛋含传统的α螺旋-转角-α螺旋结构，而以 3 个α-螺旋环绕 6 个反向成，通过盐桥等形成功能性二聚体结构，，其表面富含正电荷，参后对单子叶植物水稻 SNAC1 保守结构域晶体结构进行研究，CAC1 与 ANAC019 结构域折叠方式相似，该蛋白结构域一侧由β-折叠及 3 个α-螺旋缠绕组成中心半β-桶状蛋白，而另一侧处于开见，NAC 转录因子二聚体结构在进化过程中相对保守，多数 NA形式发挥调控作用[27]。

植物转录因子,生物胁迫,非生物,转录因子

2.3.1 NAC 转录因子在非生物胁迫中的作用植物经常遭受干旱、高盐等非生物胁迫，对其生长发育造成负面影响，这促使植物进化出一系列生理和分子机制以适应非生物胁迫。为更好地应对逆境胁迫，以 NAC 转录因子作为研究目标，通过分子育种方法来改善植物的胁迫耐受性很有意义。研究表明，植物在逆境胁迫下，外源激素 ABA、SA、JA、MeJA、ET 等信号分子影响 NAC 转录因子的转录水平，调控胁迫诱导基因的表达，响应逆境胁迫（图 1-2）[45-47]。ABA 信号分子最为常见，由于启动子元件存在差异，一般受ABA 依赖性和 ABA 非依赖性信号途径的调控[48]。Puranik 等[11]提出 NAC 转录因子在非生物胁迫过程中转录调控网络，启动子区域存在多个胁迫响应元件，例如典型的 ABA 依赖性信号转导顺式作用元件 ABREs，ABA 非依赖性信号转导的顺式作用元件 DREBs（干旱）、LTREs（低温）等，可结合相应的胁迫转录因子，激活或抑制 NAC 基因的转录水平。
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S682.21

【参考文献】