（E）-beta-法尼烯介导的除虫菊—蚜虫—瓢虫分子生态机制研究

发布时间：2020-06-13 05:05

【摘要】：除虫菊(Tanacetum cinerariifolium),为菊科多年生植物,其花头不仅具有观赏价值,更是天然杀虫活性物质——除虫菊酯的植物源。前人研究多集中在除虫菊酯的提取工艺与合成代谢。课题组前期对除虫菊田间昆虫调查发现,瓢虫在没有食物源蚜虫的情况下,大量出现在除虫菊植株上。随后,花头挥发物测定发现花中含有高量的蚜虫报警素(E)-beta-farnesene(EβF)。EβF是蚜虫受到天敌攻击时释放的一种挥发性萜类物质,用来警示其他蚜虫躲避危险。同时,蚜虫的天敌如瓢虫等能够捕获这个信号搜寻和定位潜在食物源。因此结合初步试验提出除虫菊花头可能通过释放蚜虫报警素来吸引天敌,并趋避蚜虫的假设。为了进一步阐明除虫菊基于挥发物EβF吸引瓢虫趋避蚜虫的分子生态机制,我们分别在开放田间和人工控制的实验室,通过分析蚜虫和瓢虫的取食、报警和选择行为与除虫菊EβF合成释放的关系,并克隆除虫菊EβF合成酶基因与启动子对其进行功能验证和表达特性分析。得到的主要研究结果如下:1.除虫菊EbFS基因和启动子的克隆,表达分析和功能验证克隆到两条除虫菊EβF合成酶同源基因序列EbFS1和EbFS2,分别编码575和577个氨基酸,属于萜类合酶家族。原核表达分析发现,EbFS1和EbFS2都催化FPP只产生EβF。亚细胞定位表明,EbFS1和EbFS2在细胞内的催化部位是细胞质,属于典型的倍半萜合酶。除虫菊EbFS基因在幼嫩的花器官(花苞期S1阶段)表达量最高,且特异性地在花梗和花托部位高量表达。同时克隆了除虫菊EbFS基因2.2 kb的启动子序列,构建了融合GUS报告基因表达载体转化菊花。组织染色分析表明,该启动子在靠近维管束的皮层细胞特异性表达。这些结果表明除虫菊中控制EβF合成的是一个皮层特异表达的倍半萜合成酶基因。2.分析了除虫菊EβF在自然条件和损伤处理后的释放规律对不同发育阶段除虫菊植株进行挥发物的顶空吸附和GC-MS测定,分析发现营养生长阶段挥发物释放量较低,但是转入生殖生长之后,挥发物种类和含量(萜类为主)急剧增加。初花期除虫菊挥发物中EβF释放量最高,成为主要的萜类挥发物。随着花朵的发育,另一个倍半萜大根香叶烯D快速增加,掩盖了EβF成为丰度最高的挥发物。除虫菊EβF释放迅速地响应机械损伤,并从未损伤状态下的130 ng/h/株释放量增加到5000 ng/h/株。除虫菊EβF是从损伤部位大量释放出来,在两小时后恢复到正常水平。蚜虫取食花器官并不能增加EβF的释放。这些结果表明除虫菊EβF的释放受到发育阶段调控,并响应机械损伤。3.阐述了除虫菊EβF储存和释放部位通过对除虫菊不同器官内含物提取和GC-MS分析,发现花头和花梗均含有高量的EβF,花头中最主要的两个萜类物质是EβF和大根香叶烯D,而花梗中几乎仅有EβF。对花头和花梗新鲜切片进行萜类特异的联苯胺反应(NADI)染色发现,紫色的萜类油状物质(主要是EβF)大量分布在维管束附近的皮层细胞。这些结果表明除虫菊EβF在花梗和花托大量合成,并暂时储存在皮层细胞。4.分析了蚜虫蜜露挥发物及其对蚜虫个体的行为影响通过收集取食除虫菊花梗的蚜虫蜜露,GC-MS分析发现蜜露中含有挥发性萜类物质EβF,而对照植物本氏烟草饲养的蚜虫蜜露未检测到EβF,这表明蚜虫在取食除虫菊过程中摄入了植物的EβF,并从蜜露中分泌出来。为了模拟含有EβF的蜜露对蚜虫行为的影响,利用含10 ng/μl EβF的人工蜜露,进行蚜虫报警行为实验,结果表明蜜露中EβF对蚜虫产生报警效果。5.揭示了除虫菊-蚜虫-瓢虫三者生态关系强制接种蚜虫到除虫菊植株上繁殖三代之后能得到适应性的蚜虫群体。相对于适应除虫菊的蚜虫,非适应性的蚜虫在除虫菊花头上活动更频繁,表现出明显的不安。EPG电刺吸监测系统分析蚜虫在除虫菊不同器官(花梗、叶片、叶柄)上取食行为,发现蚜虫在每个植物器官取食时都存在完整的取食波,说明蚜虫在除虫菊上能够进行基本的生命活动。进一步利用适应和未适应除虫菊或EβF的蚜虫,开展除虫菊S2花朵挥发物对蚜虫报警行为实验,结果表明非适应性的蚜虫趋避除虫菊主要是因为除虫菊花头挥发物中的EβF。室内控制条件下瓢虫行为试验表明,与其他发育阶段的除虫菊相比,花苞期除虫菊显著地吸引瓢虫,而且机械损伤促进这种吸引效果。综上所述,花蕾期除虫菊通过自发地释放高量较纯的EβF显著吸引瓢虫,同时趋避蚜虫。机械损伤显著促进除虫菊EβF的释放,从而增强瓢虫的吸引效果。除虫菊EβF在花头和花梗中靠近维管束的皮层细胞特异合成并短暂储存,随后被转移到除虫菊花头和花梗的分泌腔中储存。蚜虫能够在取食初级阶段刺探到皮层储存的EβF并摄入体内,最终在蚜虫蜜露中释放出来,达到进一步报警蚜虫的效果。该研究首次揭示了除虫菊花器官中高量合成并释放蚜虫报警素EβF来吸引瓢虫,并趋避蚜虫的双重防御机制,有效地保护了除虫菊最重要的生殖器官:花朵。该研究为以后利用植物源信息素进行生物防治和生态保护提供新的思路和手段。
【图文】：

植物,模拟系统,器官,果实

beta-法尼烯介导的除虫菊-蚜虫-瓢虫分子生态机制研究5图1-1 植物（果实和营养器官）模拟系统(Schaefer and Ruxton 2009)海红豆（Adenanthera pavonina） (a) 和短柄苹婆（Sterculia brevissima）(b) 彩色的种子，研究表明这两个植物能够通过模拟肉质果来增加种子扩散效率。植物上黑色的斑点是模拟捕食性昆虫（c）。叶片色彩也是植物为了保护叶片不受害虫啃食，模拟受伤叶片的着色(d和e)。Fig 1-1. Examples of possible mimicry in fruits and vegetative tissueColourful seeds, such as those of Adenanthera pavonina (a) and Sterculia brevissima (b), have beensuggested to enhance dispersal by mimicking fleshy fruits. Dark plant colours have been hypothesised tomimic predator infestation, such as in Xanthum trumarium (c). Leaf variegation has been hypothesised tohave a protective function by mimicking leaf damage by herbivores, as highlighted by the colouration of anintact leaf of Caladium steudneriifolium (d) compared with that of a damaged leaf that was attacked bymining moth caterpillars (e)(Schaefer and Ruxton 2009).

分子机制,蚜虫,报警信号,植物

华中农业大学 2019 届博士研究生学位（毕业）论文10图1-2 蚜虫识别报警信号的分子机制Fig 1-2. Molecular basis of alarm pheromone detection in aphids (Zhang et al2018)1.3.1 植物中 EβF 释放调控规律植物在生长过程中时刻遭受各种胁迫因素危害，如病菌、机械损伤、虫害、极端温度等，为了响应或者应对这样的威胁，植物必须调整它们的生理状态。通过释放挥发物作为植物与植物，甚至植物与昆虫之间信号交流和传递的方式，，是植物迄今进化出的比较经典的防御体系(Ueda et al 2014)。植物通过组合不同种类的挥发物来传递不同的信号。马铃薯野生种（Solanumberthaultii Hawkes）中，自然状态下就能够从B型腺体中组成型释放EβF(Gibson and Pickett 1983)；而有些植物EβF属于诱导型释放，在自然状态释放量很低，却在遭受虫害一段时间之后大量从损伤部位诱导释放出来，如樟子松（Pinus sylvestris）、棉花（Gossypium hirsutum L.）、马铃薯（Solanumtuberosum）、土狼烟草（Nicotiana attenuata）、玉米（Zea mays L.）等植物在害虫取食叶片一段时间之后
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S682.19

【参考文献】