白菜型冬油菜抗冻蛋白的分离及BrAFP1基因克隆与功能分析

发布时间：2020-06-14 17:56

【摘要】：植物抗寒性表现复杂的数量性状特征,涉及基因数量众多,已被分离的抗寒相关基因对抗寒性的影响都很有限,缺乏高贡献率的主效基因是作物抗寒分子育种等的主要限制因素。AFPs能直接结合冰晶表面,降低冰点和消除冰晶危害,在植物抗冷冻中发挥至关重要的作用。白菜型冬油菜陇油7号可抵御-30℃极端低温,是目前我国最为抗寒的冬油菜品种,本文以白菜型冬油菜陇油7号为材料,探讨了低温对陇油7号幼苗生理生化特性及其光合特征的影响;并从低温处理后的陇油7号幼苗中,分离鉴定了冬油菜抗冻蛋白BrAFP1;并克隆了BrAFP1基因,分析了BrAFP1基因在低温下表达的时空特征,初步验证了基因功能等,主要结果如下:1.探讨了低温胁迫对白菜型冬油菜幼苗生理生化及光合特征的影响,结果表明(1)常温下,白菜型冬油菜叶绿体呈梭形或椭圆形,基粒片层垛堞结构完整清晰,基质片层排列整齐有序,叶绿体内含有淀粉粒。-4℃处理24 h后,白菜型冬油菜幼苗叶片叶绿素含量明显降低;弱抗寒冬油菜品种天油4号叶绿体数量减少,部分叶绿体外膜破裂,基质片层断裂、仅留片层残段,叶绿体内已无淀粉粒积累,液泡膜明显收缩,液泡体积明显变小;气孔处于关闭与半关闭状态;陇油7号基粒仍能保持其垛堞结构的完整性,大部分基质片层完整连续,少数片层膜出现破损,叶绿体内仍有少量淀粉粒积累,液泡膜完整;气孔处于半关闭状态。(2)低温胁迫下,白菜型冬油菜不同品种幼苗叶片抗氧化酶活性(SOD、CAT、POD、APX)、渗透调节物质(SS、SPr、Pro)和丙二醛含量(MDA)、相对电导率均呈升高趋势;电导率的增加幅度因品种抗寒性不同而存在很大差异,强抗寒品种上升幅度小于弱抗寒品种,表明强抗寒品种能够较好维持质膜完整性。2.分离鉴定了白菜型冬油菜抗冻蛋白BrAFP1,对其进行了亚细胞定位;克隆了BrAFP1基因,主要结果为:(1)低温处理后陇油7号幼苗叶片的全蛋白提取物中,分离出具有冰晶形态修饰和重结晶抑制活性的蛋白质,被质谱鉴定为β-1,3-葡聚糖酶,为白菜型冬油菜抗冻蛋白,命名为BrAFP1,BrAFP1被定位于细胞核和细胞质中。(2)白菜型冬油菜BrAFP1基因ORF序列长1032 bp,编码343个氨基酸,含有信号肽,分子量38.130 kDa。在低温胁迫下BrAFP1基因表达上调,表明该基因在白菜型冬油菜低温响应中起着重要作用。3.利用BrAFP1过表达转基因株系及拟南芥afp1突变体,初步分析了BrAFP1基因功能,结果表明:与野生型植株相比,低温下过表达转基因植株BrAFP1基因表达水平增加3.76倍,其电导率和MDA含量明显降低;而突变体afp1该基因表达水平一直维持在很低水平,其渗透调节物质含量均明显降低,电导率和MDA含量明显升高。表明低温下BrAFP1基因过表达可以增加植株对环境的冷适应性,而突变体afp1植株对低温更为敏感。4.克隆抗寒性不同的14个白菜型冬油菜品种BrAFP1基因均编码了含有343个氨基酸的疏水蛋白。其碱基共有5处突变,其中3处同义突变(488位、749位和992位),2处有义突变(第52位和607位),引起2个位点的氨基酸替换。5.选取不同抗寒冬油菜典型代表性品种陇油7号、陇油8号、天油4号为材料,分析BrAFP1基因表达的时空特征。结果表明:(1)低温处理3 h后叶片内BrAFP1基因表达量显著升高,18 h-24 h其表达量达到最高值,之后随着冷胁迫时间的增加,表达量开始迅速下降;而地上部分叶片BrAFP1基因表达量显著高于叶柄和根部组织。另外,在受到4℃、-4℃冷胁迫后,白菜型冬油菜幼苗叶片BrAFP1基因表达显著被诱导,而-8℃冷胁迫后BrAFP1基因表达明显降低,植株叶片出现了明显冻害症状。(2)选取两端材料超强抗寒冬油菜陇油7号和弱抗寒材料天油4号,幼苗-4℃处理0 h、12 h、24 h、48h后,结果表明:在处理24 h后,陇油7号幼苗叶片中CNGC、ICE1基因表达量显著升高,而低温后12h后OST1、CBF2基因表达即被冷诱导。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S634.3
【图文】：

冬油菜,幼苗形态,低温,叶色

甘肃农业大学 2019 届学术型硕士研究生学位论文叶片完全展开，株型半直立；-4℃处理 24h 后，超强抗寒品种陇油 7 号、陇油 8 号、陇油 9 号叶片深绿色且有光泽，叶色未发生变化，叶面大且平展，叶柄平直，未见冻害症状出现；强抗寒品种天油 4 号、天油 15 号、冬油 8 号、冬油 7 号叶色加深，下部叶色变浅，叶面平展，叶柄略微向下弯曲，下部叶的叶尖与叶缘黄化，叶片未有明显冻伤心叶无明显受害症状；弱抗寒品种 12 天油 4 号、捷油 1 号、12 天油 5 号、12 天油 2 号、Largo 叶色呈灰褐色，大部分叶片叶尖、叶缘已出现水渍状冻斑或已干枯，呈水渍样冻伤，出现冻害症状；200119、14Nibe 叶色变为灰褐色，整体出现严重冻害症状，下部叶片已黄化干枯，心叶叶缘已经呈水渍样冻伤，叶片边缘黄化且抗冻性大幅降低。

冬油菜,低温,叶片,抗寒性

但不同品种升高幅度明显不同（图2-2）。陇油 7 号和天油 2 号 SOD 活性升高幅度较大，分别升高 165.75%、146.28%；14Nibe升幅最小，为 1.91%。表明低温下白菜型冬油菜幼苗抗氧化能力显著提高，可有效清除在低温逆境下机体产生积累的活性氧等自由基，增强机体对低温的抵御能力。低温下，不同冬油菜品种间抗氧化物酶活性存在显著差异，总体而言，抗寒性较强的冬油菜品种抗氧化物酶活性高于抗寒性较弱的品种/系。强抗寒品种（17 陇油 7 号、12 陇油 8 号、陇油 9 号、天油 4 号、天油 15 号、冬油 8 号）SOD 明显高于弱抗寒品种（冬油 7 号、12 天油 4 号、捷油 1 号、天油 5 号、天油 2 号、Largo）和冷抗寒品种（200119、14Nibe）。常温下，陇油 7 号 SOD 活性最高为 169.18 μg·g-1FW·min-1，天油 2 号最低为90.09 μg·g-1FW·min-1，两者相差 1.9 倍。低温下，SOD 最高是陇油 7 号为 334.93μg·g-1FW·min-1

【相似文献】