梅花锌指蛋白基因PmZAT12和PmBBX32在低温胁迫下的功能研究

发布时间：2020-06-15 22:09

【摘要】：梅(Prunus mume)品种繁多,花姿丰富。由于受北方冬季低温的限制,大多数品种不能露地过冬,因此培育出抗寒性更强的梅花,有极其重要的园林应用价值和广阔的市场前景。锌指蛋白是一类通过调控下游基因的表达来影响植物的生长发育和应答低温胁迫,具有“手指状”结构域的转录因子。本研究基于‘雪梅’叶片4℃低温处理下的基因表达谱和梅花基因组数据,克隆了梅花5个C2H2型和1个BBX型锌指蛋白基因,分析6个目的基因在低温胁迫下的表达变化,构建6个超量表达载体并分别转化拟南芥,通过对转基因拟南芥植株的低温胁迫处理,初步确定其抗寒性功能,并对超表PmBBX32基因拟南芥进行了相关生理指标测定和基因表达分析。主要研究结果如下:1、从‘雪梅’叶片克隆5个C2H2型锌指蛋白基因(PmZAT9、PmZAT10A、PmZAT10B、PmZAT11、和PmZAT12)和1个BBX型锌指蛋白基因(PmBBX32)并进行低温诱导下的表达量检测。结果表明,这6个目的基因对低温诱导都有不同程度的响应。在C2H2型锌指蛋白基因中PmZAT12和PmZAT10A对低温诱导的响应比另外3个基因(PmZAT9、PmZAT10B和PmZAT11)强烈;BBX型锌指蛋白基因PmBBX32对低温诱导有微弱响应。2、构建6个目的基因的超量表达载体,分别转化拟南芥。得到了转PmZAT9、PmZAT12和PmBBX32基因的T_3代纯合株系,转PmZAT10A基因的T_2代单拷贝株系,转PmZAT10B和PmZAT11 T_1代阳性苗。3、转基因拟南芥低温抗性鉴定。与野生型相比,低温处理下超表PmZAT12基因的拟南芥株系存活率降低,超表PmBBX32基因的株系存活率提高,而PmZAT9和PmZAT10A的超表株系的存活率与野生型相比并无显著差异。4、转PmBBX32基因拟南芥生理指标检测和基因表达分析。与野生型拟南芥相比,转PmBBX32基因拟南芥具有更低的相对电导率和ROS积累量,以及更高的抗氧化酶活性和脯氨酸含量,说明PmBBX32基因的超表降低了低温对植株的伤害,同时可能通过提高抗氧化酶活性和脯氨酸的含量增强了植株的抗寒性。此外RT-PCR结果表明超表PmBBX32可以上调冷胁迫和SOD相关基因的表达,从而提高植株的抗寒性。5、超表PmZAT12和PmBBX32拟南芥开花表型分析。形态指标统计结果表明,超表PmZAT12和PmBBX32拟南芥的开花时间明显晚于野生型,并且均具有矮化特征。并且转基因拟南芥开花时莲座叶叶片数量与野生型相比显著增多,推测转基因拟南芥的表型可能是与植物本身的发育缓慢有关。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S685.17
【图文】：

8 数据处理所有实验数据均为 3 次及以上独立重复试验的均值。利用 IBM SPSS Statistics 1对所有数据进行方差分析，并在P<0.05或P<0.01水平做Duncan’s Mutiple Rangts，作图采用 SigmaPlot 10.0 和 Excel 2010 软件。结果与分析1 目的基因的克隆和同源蛋白序列分析根据‘雪梅’叶片在 4℃低温处理下的基因表达谱和梅花基因组数据，筛选出H2 型锌指蛋白的 5 个基因（Pm000815、Pm002762、Pm005390、Pm17805 和021284）和 BBX 型锌指蛋白 Pm013051 作为目的基因。以‘雪梅’叶片的 cDNA 为，根据从梅花基因组中下载目的基因的序列，设计引物扩增如图 1。序列分析果表明，Pm000815、Pm002762、Pm005390、Pm013051、Pm017805、Pm02128完整的开放阅读框区域，长度分别为 537bp、555bp、795bp、795bp、1191bp 和bp，编码氨基酸数分别为 179、185、275、275、397 和 242 个。A B

20图 2 目的基因蛋白与其它物种同源蛋白序列比对（A） Pm000815、Pm002762、Pm005390、Pm017805、Pm021284 蛋白与李属和拟南芥同源蛋白序列比对（B） Pm013051 蛋白与其它物种同源蛋白序列比对。Fig. 2 Sequence alignment of the target gene protein with the homologous proteins of otherspecies(A) Sequence alignment of Pm000815, Pm002762, Pm005390, Pm017805 and Pm021284 protein with the homologousproteins of Prunus and Arabidopsis thaliana (B) Sequence alignment of Pm013051 protein with the homologousproteins of other species.

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本文编号：2715069