菠菜（Spinacia oleracea L.）毛状根诱导与高效基因组编辑体系的建立

发布时间：2020-06-16 19:24

【摘要】：发根农杆菌(Agrobacterium rhizgones)侵染植物后,可诱导植物产生毛状根。菠菜(Spinacia oleracea L.)是常见的食用蔬菜,目前尚未有菠菜毛状根的研究报道。本研究筛选到适合诱导菠菜毛状根的发根农杆菌菌株LBA9402。结果表明,LBA9402侵染菠菜外植体茎后,毛状根的诱导率最高可达16%。菠菜毛状根呈白色,具有丰富的根毛,能在无外源激素的固体培养基上快速增殖生长。通过诱导菠菜毛状根产生愈伤并进行分化,获得了菠菜毛状根的再生株。此外,本研究实现了发根农杆菌的Ri质粒与携带外源GFP基因的Ti质粒的共转化,PCR结果和荧光显微镜观察显示,发根农杆菌Ri质粒的rol B基因以及Ti质粒中GFP基因已在菠菜毛状根基因组中稳定表达。CRISPR/Cas9是一种基因组高效定点突变的工具,已广泛应用于模式植物和各种作物。尽管菠菜的基因组序列被公布,但CRISPR/Cas9技术尚未成功地应用于菠菜。在上面研究的基础上,我们以菠菜的毛状根为研究对象,使用CRISPR/Cas9精确编辑两个类纤维素合成酶 D 基因(Cellulose Synthase-Like D genes CSLD),Spo2331和Spo10340,探究其参与菠菜毛状根根毛形成的机制。结果表明,CRISPR/as9可在菠菜中形成四种突变类型,即置换,插入,删除和组合突变,其中删除突变所占比重最高,约占64.1%。每个靶位点之间的突变率具有很大差异。15个Sp02331独立的转基因毛状根系中,有7个是纯合或双等位基因突变根系,其他8个是杂合突变根系,所有纯合突变根系显示出根毛膨胀和变短的表型,与拟南芥csld2突变体的表型特征相似。获得的15个Spo10340独立的转基因发根系中,有13个杂合突变系根系,但没有获得纯合或双等位基因突变根系,所有杂合突变根系与正常毛状根无明显差别。菠菜CRISPR/Cas9系统的建立为菠菜的功能基因的鉴定以及菠菜的分子育种奠定了基础,在菠菜的基础研究和应用研究领域均具有重要意义。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S636.1
【图文】：

示意图,启动子,中修,红色

改造而来的。将ｐＹＬＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９Ｐ３５ｓ－Ｂ邋（基因号：ＡＩ１３３７２９．１）中的５似１切割位点片逡逑段和ＣＣＤＢ替换为包含一个ＡｔＵ３ｂ邋ｓｎＲＮＡ启动子和两个新的Ｉ切割位点的序列逡逑（图２Ａ）。从ｐＹＬｓｇＲＮＡ－ＡｔＵ３ｂ邋（基因号：ＫＲ０２９０９７．１）扩增ＡｔＵ３ｂ启动子序列。然后逡逑根据Ｍａ（Ｍａ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１６）和Ｘｉｅ（Ｘｉｅ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１６）的方法具体步骤如下：从包含ｔＲＮＡ和逡逑ｓｇＲＮＡ序列的ｐＧＴＲ载体中扩X椘危ㄒ镄蛄腥绫恚玻此荆缓蠼脑斓牡脑靥邋义希ǜ脑斓模穑伲蹋茫遥桑樱校遥茫幔螅瑰澹常担螅拢┖屠┰銎位旌希琹Mａ邋Ｉ酶切和Ｔ４连接反应一步法逡逑连接合成（图２Ｂ）。逡逑一步法连接反应体系：也ａ邋Ｉ邋（购于ＮＥＢ公司）１５邋Ｕ，１０ｘ５ａｓ邋Ｉ邋ｂｕｆｆｅｒ邋１．５邋｜ｘＬ，Ｔ４连逡逑接酶５０邋Ｕ，载体０．５明，目的胶回收片段３０邋ｍｇ，去离子水补齐１５队反应总体系。一逡逑步法连接ＰＣＲ程序：３７邋°Ｃ酶切１０邋ｍｉｎ，邋１０邋°Ｃ连接５邋ｍｉｎ，２０°Ｃ延伸１０邋ｍｉｎ，３个循逡逑环，３７邋°Ｃ酶切１０邋ｍｉｎ，１０邋°Ｃ连接５邋ｍｉｎ，２０邋°Ｃ延伸１０邋ｍｉｎ，１０个循环，程序结束后逡逑４邋°Ｃ保存于冰箱备用。逡逑１５逡逑

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２００８）。为了得到菠菜毛状根的最适生长培养基，将ＬＢＡ９４０２诱导的菠菜毛状根，分别置逡逑于固体和液体两种培养基上进行继代培养。对整个培养过程持续观察发现，菠菜毛状根在液逡逑体培养基中生长缓慢（图３－３Ｄ），甚至出现了褐化的现象（图３－３Ｇ）。而固体培养基上继代逡逑的毛状根生长旺盛（图３－３Ｂ）。对２种培养条件下生长的毛状根进行称重，在培养了邋２１邋ｄ后逡逑固体培养基上的毛状根鲜重的增长倍数高于液体培养基４４倍（图３－３Ｅ）。将液体培液中生逡逑长的毛状根取出，吸干水分后继续在固体培养基上进行培养，毛状根又可恢复生长，长出健逡逑康的毛状根分支。逡逑２１逡逑

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