黄瓜圆叶突变体基因Csrl的图位克隆和功能分析

发布时间：2020-06-18 14:27

【摘要】：叶片是植物的重要源器官,在植物的光合、呼吸和光感受中必不可少。叶片形态是植株形态建成的组成部分,叶形是“理想株型”的重要构成要素,对于植株生长发育和农业生产非常重要。挖掘和克隆叶形控制基因,对于揭示植物叶形的调控机理和加快作物的株型育种进程具有重要意义。目前已在其它植物上克隆了多个叶形控制基因,但在葫芦科作物上,对叶形控制基因的挖掘很少见报道。课题组从黄瓜(Cucumis sativus L.)自交系CCMC的EMS突变体库中,鉴定了2个圆叶突变体C356和C949,本研究以此为材料,采用图位克隆并结合MutMap的方法,对黄瓜圆叶基因Csrl-1和Csrl-2进行克隆,并对候选基因进行了初步的功能分析。研究结果为进一步研究黄瓜叶形调控机制奠定了基础。主要研究结果如下:1.黄瓜圆叶突变体表型及其遗传分析对突变体C356和C949的表型进行了观察,结果表明,与野生型相比,两个突变体均表现为叶形为圆形,叶缘相对光滑,花萼片缺失或减少,雌花的花瓣顶端闭合成棒状。与突变体C356的植株相比,突变体C949的植株相对较低。对突变体的圆叶性状进行的田间调查结果表明,两个突变体的F_1均呈现正常叶形。在F_(2:3)群体中,正常叶形植株与圆形叶植株的分离比经卡方检验均符合3:1的性状分离比例,此结果表明C356和C949的圆叶性状分别是由隐性单基因Csrl-1和Csrl-2所控制的质量性状。2.黄瓜圆叶突变体基因Csrl的克隆及鉴定对调控C356和C949圆叶性状的Csrl-1和Csrl-2基因分别进行了精细定位。用1196株F_2分离群体,和18对多态性SSR标记及新开发的dCAPS标记,通过遗传作图将Csrl-1基因定位在黄瓜Chr1的188.9kb的区域内。MutMap分析结果表明,在Csrl-1定位区间内,只有一个位于CsPID1基因中的非同义SNP1G19389180符合其过滤标准。结合Csrl-1定位区间内的基因及MutMap分析结果,CsPID1基因是Csrl-1最可能的候选基因。对Csrl-1候选基因CsPID1进行了克隆,序列比对结果表明,在C356的CsPID1基因CDS区发生了C~(1000)到T~(1000)的碱基突变,导致野生型的Pro~(334)置换为C356中的Ser~(334)。利用该非同义突变的SNP开发的dCAPS标记NWdCAPS360在大群体中进行了连锁分析验证,结果表明,该标记与交换单株共分离;为了检测该SNP位点是否在自然种质中存在,利用该标记对100份黄瓜自然种质进行了位点唯一性检测,结果表明,该SNP位点只存在于突变体中。利用与Csrl-1相同的SSR分子标记,将Csrl-2基因也定位于188.9kb区域内且是相同的候选基因CsPID1,利用MutMap的方法,也发现只有一个位于CsPID-1基因中的非同义SNP1G19389177符合其过滤标准,结合Csrl-2定位区间内的基因及MutMap的分析结果,CsPID1基因是Csrl-2最可能的候选基因。对突变体C949和野生型CCMC的Csrl-2候选基因CsPID1进行克隆,序列比对结果表明,C949在CsPID1基因CDS区1003 bp位点处发生了G到A的碱基突变,导致野生型中的Glu~(335)置换为C949中的Lys~(335)。C356和C949的候选基因均为CsPID1,但是在两个突变体中该基因的突变位点不同。对这两个突变体进行了等位性检测,结果显示杂交后代中正常叶植株与圆形叶植株的分离比均符合3:1的性状分离比例。Csrl-2是Csrl-1的等位基因。3.CsPID1基因功能的初步分析通过qPCR检测CsPID1在CCMC和C356不同组织器官的表达。结果表明与野生型相比,CsPID1基因在C356的根、叶和雌花中表达量显著降低。这可能与导致rl-1突变体中较不发达的根,圆叶和异常的雌花器官有关。CsPID1编码Ser/Thr蛋白激酶,参与生长素输的极性运输。生物信息学分析发现在黄瓜基因组中有3个同源基因:CsPID1,CsPID2和CSPID2L(CsPID2-like),而CsPID1基因在野生型和C356的叶片中的表达有显著差异,表明CsPID1基因在圆叶形成过程中可能起主要作用。同时将35S-CsPID1过表达载体转化拟南芥,阳性转基因植株出现与过表达拟南芥AtPID基因部分相似的表型,这一结果也支持CsPID1为候选基因。4.突变体雌不育现象通过解剖学观察、花粉活力鉴定、正反交测试、荧光电镜扫描及qPCR分析等一系列的分析,发现突变体植株花粉粒的育性正常,利用雄花作为父本授粉均能正常结实产生种子,表明了突变体果实无种子可能是由于雌性不育导致,进一步研究表明,突变体的雌性不育是由于突变体内没有胚珠不能完成受精所致。CsPID1基因功能的丧失可能对生长素的流出造成干扰,导致黄瓜子房胎座形成初期以及胚珠原基生长所需的生长素最大值的形成失败或延迟,最终导致不能形成胚珠。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S642.2
【图文】：

子叶,成株,真叶,表型

第二章突变体基因 Csrl 的图位克隆和初步功能分析.3 结果与分析3.1 C356 和 C949 圆叶突变体表型观察分析3.1.1 C356 圆叶突变体表型观察分析圆叶突变体 C356 部分植株子叶发育异常，呈现 3 子叶或者子叶扭曲分裂等表叶呈圆形，叶缘光滑，幼苗期开始到成熟期其性状表现稳定。就叶形特征来说，T（CCMC）相比，突变体 C356 是具有相对平滑边缘的圆叶表型（图 2-1；图 2-2A子叶阶段，一些突变植物表现出多子叶或子叶的非对称发育（图 2-1D）。而且在体中叶片的叶缘光滑，叶缘锯齿数目相对较少（图 2-2B）。

突变体,形态特征,叶突,叶缘

西北农林科技大学博士学位论文图 2-2 野生型和突变体叶缘锯齿的扫描叶片图像（A）和每片叶片上叶缘锯齿的平均数（B）（**表示 P<0.01）Fig. 2-2 Scanned leaf images of CCMC and C356 (a) showing serration of leaf margins and mean numberof serrated teeth on each leaf (b), respectively (**P<0.01)2.3.1.2 C949 圆叶突变体表型观察分析圆叶突变体 C949 同样是部分突变体的植株子叶发育异常，幼苗期至成熟期，均能观察到突变体与野生型叶片形态的表型差异（图 2-3）。与突变体 C356 相比，突变体C949 的植株相对较低。与 WT（CCMC）相比，突变体 C949 的子叶也是多子叶或非对称发育（图 2-3D）。

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