芥菜HDA9和AGL19克

发布时间：2020-06-20 17:54

【摘要】：芥菜(Brassica juncea)是芸薹属中重要的蔬菜作物,全国各地都有种植。芥菜从营养生长转向生殖生长需要经历成花转变。花期的提前或延迟,会影响生产栽培、品种选育和F1代制种。前期报道,HDA9去乙酰化作用于AGL19的组蛋白H3和H4,影响其染色质环境,然后两者共同影响FT的表达,从而导致花期推迟。但HDA9、AGL19是否可直接调控核心开花整合子SOC1、AGL24,目前并不清楚。本试验拟克隆芥菜BjuHDA9和BjuAGL19,通过酵母双杂交、pull-down、酵母单杂交、双萤光素酶检测等多种方法,深入研究BjuHDA9和BjuAGL19分别与开花整合子BjuSOC1和BjuAGL24的作用机制,为芥菜花期分子调控和“未熟抽薹”调节等奠定基础。试验结果如下:1.BjuHDA9和BjuAGL19基因的克隆及生物信息学分析以芥菜茎尖为试验材料,同源扩增得到BjuHDA9和BjuAGL19基因,分别为1284bp和666bp。其中BjuHDA9编码426个氨基酸,预测蛋白分子量为48.73kDa,理论等电点为5.26。BjuAGL19编码221个氨基酸,预测蛋白分子量为25.16 kDa,理论等电点为8.94。2.BjuHDA9和BjuAGL19基因的表达模式研究BjuHDA9和BjuAGL19基因在根、茎、叶、花、花蕾五个组织里均有表达,其中BjuHDA9主要在叶中表达量较高,在茎中的表达相对较低;BjuAGL19的表达主要在根中。短日照条件下,BjuHDA9在各个组织中的表达量均有上升;而长日照和春化途径下,BjuHDA9的表达量下降。3.BjuHDA9和BjuSOC1、BjuAGL24蛋白之间的互作分析酵母双杂交试验表明,BjuSOC1不是BjuHDA9的靶蛋白,而BjuHDA9也不与BjuAGL24蛋白互作。Pull-down试验结果与酵母双杂交相一致,进一步证实了这一结论。4.BjuAGL19与BjuSOC1、BjuAGL24蛋白之间的互作鉴定酵母双杂交试验表明,BjuAGL19与BjuSOC1之间不存在相互作用,但BjuAGL24是BjuAGL19的靶蛋白,BjuAGL19可以直接与BjuAGL24相互作用。Pull-down试验结果与酵母双杂交结果相一致,进一步证实了这一结论。5.BjuHDA9与BjuSOC1、BjuAGL24启动子互作检测酵母单杂交表明,Y1HGold[(pAbAi-BjuSOC1)×(pGADT7-BjuHDA9)]能够在SD/-Leu/AbA~(100)固体培养基上正常生长,而Y1HGold[(pAbAi-BjuAGL24)×(p GADT7-BjuHDA9)]能够在SD/-Leu/AbA~(350)固体培养基上正常生长,说明BjuHDA9蛋白能与BjuSOC1和BjuAGL24启动子相互作用。双萤光素酶活性检测结果也表明,BjuHDA9蛋白与BjuSOC1和BjuAGL24启动子在植物体内存在互作。进一步筛选BjuHDA9蛋白与BjuSOC1、BjuAGL24启动子的作用区域。酵母单杂交表明,Y1HGold[(pAbAi-BjuSOC1-3)×(pGADT7-BjuHDA9)]能够在SD/-Leu/AbA~(100)固体培养基上正常生长,同时Y1HGold[(pAbAi-BjuAGL24-3)×(pGADT7-BjuHDA9)]能够在SD/-Leu/AbA~(350)固体培养基上正常生长。双萤光素酶检测结果与酵母单杂交结果相一致,说明BjuHDA9蛋白能与BjuSOC1启动子截短体片段BjuSOC1-3相互作用,而BjuHDA9蛋白同样与BjuAGL24启动子截短体片段BjuAGL24-3能互作。6.BjuAGL19与BjuSOC1、BjuAGL24启动子互作检测酵母单杂交表明,Y1HGold[(pAbAi-BjuSOC1)×(pGADT7-BjuAGL19)]在SD/-Leu/AbA~(100)固体培养基上不能长出白色菌斑,而Y1HGold[(pAbAi-BjuAGL24)×(pGADT7-BjuAGL19)]同样在SD/-Leu/AbA~(350)固体培养基上不能长出白色菌斑,说明BjuAGL19蛋白与BjuSOC1和BjuAGL24启动子之间均不存在相互作用。双萤光素酶活性检测结果也表明,BjuAGL19蛋白与BjuSOC1和BjuAGL24启动子在植物体内没有相互作用。7.BjuHDA9突变体与BjuSOC1、BjuAGL24启动子互作检测试验分别选取芥菜BjuHDA9蛋白的第172、174和261这三个位点,利用重叠延伸PCR对选定的氨基酸位点进行定点突变,分别将这三个氨基酸置换为丙氨酸,研究结果发现BjuHDA9突变体仍能与BjuSOC1、BjuAGL24启动子相互作用,但作用强度减弱。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S637
【图文】：

西南大学硕士学位论文cription activation domain，AD）[91]。 DNA-BD 可特异性结合上游激活eam activating sequence，UAS）；然后 AD 聚集 RNA 聚合酶 II 复合物基因的转录。 DNA-BD 和 AD 分开时仍各具功能，但不能激活转录通过适当一定的途径在空间上相互接近时，才能重新呈现完整的转录因活上游序列的启动子，启动下游靶基因的转录[92]。基于这一特性，将两个与 DNA-BD 和 AD 结构域融合，形成的融合蛋白分别称为 bait ，或已知蛋白、Y 蛋白）和 prey 蛋白（即猎物，或靶蛋白、X 蛋白）个待测蛋白之间能够相互作用，它们便能够重新具有完整的转录因子活性序列的启动，启动下游靶基因的转录[94]（图 1-1）。

第 1 章 文献综述-DNA 互作的研究方法胞生命活动中，许多的活动均涉及到 DNA 与蛋白质之间的相互作用的问发展出了一系列研究 DNA 与蛋白质相互作用的方法，如酵母单杂交实验（id system，Y1H）、凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay，EMS疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay，CHIP）等。母单杂交系统单杂交系统（Yeast one-hybrid system，Y1H）是由酵母双杂交系统（id system，Y2H）衍化而来[97]。其基本原理是：通过将转录激活因子 GA合结构域置换为特定蛋白（prey protein）的编码基因，其编码的蛋白能与目）相互作用来激活 RNA 聚合酶 polII，启动下游的报告基因进行转录[98]。检测下游基因是否表达，就能够验证目的基因和蛋白之间是否存在相互作）。

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本文编号：2722758