柑橘上两种重要细菌性病害的纳米磁珠分离检测体系的建立及黄龙病侵染柑橘的转录组研究

发布时间：2020-06-26 05:51

【摘要】：柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)和柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter)是柑橘上两种重要的植物检疫性细菌病害,严重影响了柑橘的种植、生产以及贸易。由于缺乏有效的防治手段,病害一旦出现,如果不能及时发现和有效控制,将导致柑橘果实早熟脱落、畸形,影响柑橘的口味、产量以及进出口,给柑橘的种植造成重大的经济损失,因此,世界各国都制定了严格的法规和检疫措施来防止病害的传入和蔓延。由于重视程度、农艺和管理水平的差异、气候、环境条件的影响以及病菌侵染到柑橘发病的潜伏期不同,导致很难及时发现病原菌侵染并采取有效的排除或者根除措施,防止病害的进一步发展。样品的高效制备分离方法以及快速、准确的检测手段是病原菌筛查以及病害防治的基础。本研究系统性地建立了基于磁分离技术的柑橘溃疡病菌基因组DNA和柑橘基因组DNA纳米磁珠分离提取方法、柑橘溃疡病菌非特异性纳米磁珠分离方法以及柑橘溃疡病菌特异性免疫磁分离方法,同时建立了后续的柑橘溃疡病菌和柑橘黄龙病菌双重荧光定量PCR检测方法以及柑橘溃疡病菌双抗夹心免疫磁珠检测方法。本研究同时采用RNA-seq技术,对田间种植的柑橘甜橙受柑橘黄龙病菌侵染后的转录组进行了分析。本研究建立的柑橘溃疡病菌基因组DNA和柑橘基因组DNA纳米磁分离方法,3.3×10~8 CFU菌体和100 mg柑橘DNA提取量分别为192.8±11.7μg和89.7±5.2μg,商品化柱式DNA提取纯化试剂盒对应提取量分别为176.5±3.3μg和118.5±2.2μg,建立的DNA纳米磁分离方法与商品化柱式DNA提取纯化试剂盒提取量相当,DNA纳米磁分离方法简便快速,提取效率优于商品化柱式DNA提取纯化试剂盒。本研究建立的柑橘溃疡病菌非特异性纳米磁分离方法对菌体的平均回收率能够达到73%,磁分离菌体的活性不受影响,可直接进行涂板培养,简化了菌体的分离培养流程。磁珠对菌体的非特异性结合受缓冲液pH值的影响,使用pH 8.0 Tris缓冲液作为结合液,磁珠对菌体的结合率最高。不同缓冲液中二氧化硅包被磁珠zeta电位测试结果证实除包埋作用外,静电吸附对菌体的非特异性磁分离具有显著的影响。本研究建立的柑橘溃疡病菌双抗夹心免疫磁分离检测方法具有极强的特异性,对野油菜黄单胞菌野油菜致病型、唐菖蒲伯克霍尔德菌洋葱致病型、玉米内州萎蔫病菌、西瓜细菌性果斑病菌、玉米细菌性枯萎病菌以及水稻细菌性条斑病菌均不会产生非特异性反应。柑橘溃疡病菌双抗夹心免疫磁分离检测方法的灵敏度为3.3×10~5 CFU/mL,与普通ELISA灵敏度相当。使用本研究建立的柑橘溃疡病菌和柑橘黄龙病菌双重荧光定量PCR检测方法对免疫磁分离菌体进行检测,灵敏度从3.3×10~5 CFU/m L提高到3.3×10~2 CFU/mL,证明本研究建立的免疫磁分离方法具有极高的分离效率。田间种植的柑橘甜橙受柑橘黄龙病菌侵染后RNA-seq转录组分析结果显示,相对于健康组柑橘,罹病组柑橘在基因水平共发现88个差异表达基因,其中有57个基因呈现上调表达,31个基因呈现下调表达。转录水平上,罹病组柑橘差异表达的转录本数量为117,其中,上调表达数量为75,下调表达数量为42。与植物抗病性有关的差异表达基因产物包括Endochitinase、Glucan endo-1,3-beta-glucosidase 5、Linoleate 13S-lipoxygenase 2-1、Non-specific lipid-transfer protein、Transcription factor MYB82、Transcription factor MYB1R1、Thaumatin-like protein 1、Systemin receptor SR160、putative disease resistance gene protein(pY14)和plant defensin 2.2(PDF2.2)。与淀粉代谢相关的差异表达基因产物包括Isoamylase 2、Beta-amylase和Glucose-6-phosphate/phosphate translocator 2。其它差异表达基因产物包括Callose synthase 2、Chlorophyllase-1和Cathepsin等。研究揭示了田间自然环境中的黄龙病菌侵染柑橘与温室中人工病原接种柑橘在不同侵染周期的生理、病理差异。
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.66
【图文】：

标准曲线,探针,引物,标准曲线

2 柑橘溃疡病菌和柑橘黄龙病菌双重荧光定量 PCR 体系的建立2.3.2 柑橘溃疡病菌荧光定量 PCR 引物探针扩增效率的比较三套柑橘溃疡病菌荧光定量 PCR 引物探针的扩增标准曲线见图 2.1。xac-f1/r1/p1 引物探针扩增标准曲线方程为 y = -3.27461 x+42.99510，r=-0.99844。xac-f2/r2/p2 引物探针扩增标准曲线方程为 y = -3.56485 x+45.29504，r=-0.99950。xac-f3/r3/p3 引物探针扩增标准曲线方程为 y = -3.26974 x+44.22883，r=-0.99524。三套引物探针的扩增效率分别为 102%、91%、102%。

标准曲线,阳性对照,探针,引物

图 2.2 阳性对照转化菌 PCR 验证Fig. 2.2 Verification of positivetransformed bacterialeft: pMD 18-T/cla-1; right: pMD 18-T/cla-2Lane M: Marker; Lane 1: transformant 1; Lane 2: transformant 2; Lane 3: transformant 3;Lane 4: E.coli JM109; Lane 5: Blank control2.3.4 柑橘黄龙病菌荧光定量 PCR 引物探针扩增效率的比较两套荧光定量 PCR 引物探针的扩增标准曲线见图 2.3。cla-f1/r1/p1 引物探针扩增标准曲线方程为 y = -3.17375 x+31.54955，r = -0.99961。cla-f2/r2/p2 引物探针扩增标准曲线方程为 y = -3.22559 x+31.65494，r = -0.99983。两套引物探针的扩增效率分别为 105%、104%。

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