野生毛葡萄液泡膜水通道蛋白基因的克隆与功能验证

发布时间：2020-07-05 10:16

【摘要】：水通道蛋白在介导植物体内水分的运输、维持水分平衡,调节细胞内外的渗透平衡及应对各种非生物胁迫中起着极其重要的作用。中国西南喀斯特山区的野生毛葡萄(Vitis quinquangularis),经过长期的干旱-复水-再干旱模式的驯化,形成特有的抗旱性。为了探究喀斯特地区野生毛葡萄液泡膜水通道蛋白的结构特征,及其在干旱胁迫中所发挥的作用,本研究以极抗旱的野生毛葡萄‘花溪-9’为研究对象,不抗旱的欧洲葡萄(V.vinifera)‘红地球’为对照组材料,利用同源序列分析及RT-PCR的方法克隆得到野生毛葡萄的液泡膜水通道蛋白(TIPs)基因全长,分析了各基因的生物信息学特征、不同组织中及土壤干旱-复水条件下各基因的表达规律,研究了基因表达与水分胁迫生理指标的相关性关系,全面探究TIPs基因与野生毛葡萄抗旱性的关系,构建了基因表达载体,并成功将VhTIP2;1导入拟南芥进行了部分功能验证。主要取得以下研究结果:1.利用同源序列分析及RT-PCR法从‘花溪-9’中克隆出9个液泡膜水通道蛋白基因(VhTIP)的全长cDNA序列。9个TIP基因分别命名为:VhTIP1;1(KY379060)、VhTIP1;2(KY379061)、VhTIP1;3(KY391793)、VhTIP1;4(KY391794)、VhTIP2;1(KP276237)、VhTIP2;2(KY379062)、VhTIP3;1(KY922959)、VhTIP4;1(KY379063)、VhTIP5;1(KY922960),分别包含756、756、756、759、750、753、780、762、750 bp的完整开放阅读框。2.经蛋白结构预测,9个VhTIPs氨基酸序列均具有MIP家族信号序列SGGHINPAVT以及两个NPA(Asn-Pro-Ala)单元,分别编码251、251、251、252、249、250、259、253、249个氨基酸。将VhTIPs进行理化性质分析发现这9个VhTIPs的相对分子质量在25.27 kD~27.42 kD之间,理论等电点(pI)在4.96~7.11之间,不稳定系数在26.47~35.89之间,均为稳定性蛋白。经亲水性检测,VhTIPs蛋白的亲水平均数均在0.657~0.923之间,为疏水性蛋白。利用TMHMM-2.0软件预测了VhTIPs蛋白的跨膜区,除VhTIP1;4含有7个跨膜区外,其他8个均含有6个跨膜结构。利用SignalP3.0 Server对VhTIPs进行信号肽预测,9个VhTIPs蛋白均无信号肽。利用Plant-mPLoc在线软件对这9个基因进行亚细胞定位,均定位在液泡膜上。3.组织特异性表达分析发现9个TIP基因中的TIP1;4、TIP2;1、TIP2;2及TIP4;1在极抗旱的野生毛葡萄‘花溪-9’和不抗旱的欧洲葡萄‘红地球’的根中表达量均最高,且在‘花溪-9’中的表达量高于‘红地球’的,可能与根部水分运输、根压的调节及抗旱性的强弱相关,TIP1;4及TIP2;2只在根中特异表达,茎和叶中几乎检测不到,说明此基因主要作用于根部的水分运输。TIP1;2在‘花溪-9’叶中的表达量最高,茎中次之,根中最少,但在‘红地球’的根茎叶中几乎没有表达量,预测该基因可能参与了‘花溪-9’抗旱性调节;TIP1;3在‘花溪-9’和‘红地球’中的叶中表达量最高,根中检测不到其表达量,可能主要参与叶片的水分转运。4.在干旱胁迫过程中,‘花溪-9’根中VhTIP1;1和VhTIP5;1基因表达呈现先升高后降低的变化趋势,VhTIP1;2和VhTIP2;1呈先降低后升高趋势;复水7d后VhTIP1;1、VhTIP2;1、VhTIP3;1、VhTIP4;1和VhTIP5;1表达量恢复到对照水平;‘红地球’根中VvTIP1;4和VvTIP5;1基因也能恢复到对照水平。在茎中,‘花溪-9’的VhTIP5;1以及‘红地球’的VvTIP2;2可恢复至对照水平。‘花溪-9’叶中的VhTIP1;3和VhTIP1;4及‘红地球’的VvTIP2;1也可恢复至对照水平。5.干旱胁迫下,光合参数(净光合速率、气孔导度和蒸腾速率)、叶水势、叶片相对含水量和水力结构参数(导水率、叶比导率和比导率)会随着干旱胁迫时间的延长逐渐降低,根、茎和叶的质膜相对透性逐渐增大,细胞膜的通透性变大,稳定性逐渐降低;复水后,各指标基本能恢复到正常水平。干旱-复水条件下9个VhTIP基因的表达量与各生理指标相关性分析表明,在‘花溪-9’叶片中,各生理指标与VhTIP1;1、VhTIP1;2、VhTIP2;2、VhTIP4;1和VhTIP5;1基因的表达量呈正相关,在‘红地球’叶片中,各生理指标与VvTIP1;3和VvTIP2;1的表达量呈正相关,其中VvTIP2;1达到显著正相关,与VvTIP1;1、VvTIP1;4和VvTIP3;1基因的表达量呈负相关。TIP1;2和TIP2;1在2份材料间响应干旱逆境的差异最大。6.成功构建了植物表达载体pBI121-35S-Vh TIP2;1,利用农杆菌介导与花絮浸渍(喷雾)法相结合将VhTIP2;1成功导入拟南芥,且超量表达VhTIP2;1基因的T4代拟南芥植株的干旱胁迫耐性远高于野生型拟南芥,说明VhTIP2;1基因在野生毛葡萄‘花溪-9’抵御干旱胁迫过程中起到重要作用。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S663.1
【图文】：

序列,水通道蛋白,结构模型

基酸序列拓扑学及三维结构分析表明此四聚体结构对蛋白质的结构稳定和功能行使的正确性具有重要作用（张璐等，2014）。图1 水通道蛋白的结构模型Fig. 1 Model of the structure of an AQP引自张璐等（2014）文献。a 图中圆柱形代表 - 螺旋（TM1~ TM6），被5个环（A~ E）所连接。2个螺旋域分别有一半从相对的方向插入细胞质中，构成了水通道蛋白的核心。B环和E环具有高度保守的NPA残基。b 图中红色部分表示植物水通道蛋白的NPA结构。1.2.1.3 水通道蛋白的分类目前，已在多种植物中分离出水通道蛋白基因。在模式植物拟南芥（Chaumont etal.，2000）、水稻（Johanson et al.，2001）、玉米（Sakurai et al.，2005）、欧洲葡萄（Rebecca et al.，2009）、辣椒（陈儒钢等

示意图,导水率,测定装置,示意图

图 2 导水率测定装置示意图2 Schematic diagram of the apparatus for measuring hydraulic condu萄 VhTIPs 基因的表达模式分析中的表达模式壤干旱胁迫的‘花溪 9’和‘红地球’的根、茎、叶的光定量 PCR 仪，进行 VhTIPs 的表达分析。以葡萄 Ub）作为内参，以Ubiquitin-A和Ubiquitin-S（表8）为内参引物，反应体系为 20 μL。反应体系及程序参照 SYBR Plus）试剂盒说明书。表 7 Real-time PCR 反应体系Table 7 Real-time PCR reaction systemtion mixture 用量 Consumption 终浓

【参考文献】