日本结缕草铝胁迫转录响应及ZjOMT功能研究

发布时间：2020-07-10 04:25

【摘要】：随着全球环境气候的变化以及工业化和城市化程度的提高,南方土壤酸化加剧,对植物的生长造成了很大的危害,对人类生存环境和生活品质产生了很大影响。培育抗铝的植物品种并应用到生产生活中是一种比较直接的方法,并且具有生态、环保、经济的优势。日本结缕草是一种优良的暖季型草坪草,广泛生长在南北方的广大地区,它能在含铝量比较高的酸化土壤中生长良好,是一种耐铝的植物。为了揭示日本结缕草耐铝的分子机制,本研究对日本结缕草铝胁迫下响应的转录组进行了分析,在此基础上研究了日本结缕草ZjOMT基因的序列和功能特征,并在大肠杆菌和拟南芥中进行表达。主要结果如下:(1)日本结缕草铝响应转录组分析通过铝处理和未处理的日本结缕草转录组测序,获得了 34,743个Unigenes,其中14,555个为差异表达基因,包括4,845个下调基因和9,710个上调基因。差异表达基因中93.17%的基因为已知基因,其中314个基因尚未被注释,已经被注释的的基因中,包含大量的转运蛋白基因、转录因子、热激蛋白基因、离子通道蛋白基因、参与氧化还原反应的基因、以及参与果胶合成、柠檬酸合成等抗铝相关的基因。新基因中与离子结合相关的XLOC_007305、XLOC_010540、XLOC_03748在铝胁迫过程中表达量明显提高。KEGG富集显示:在铝胁迫下,日本结缕草中糖酵解途径、抗坏血酸和代谢、氧化磷酸化、光合作用和脂肪酸生物合成与铝胁迫响应较为密切。(2)日本结缕草ZjOMT基因克隆及表达分析从日本结缕草中克隆了一个甲基转移酶基因ZjOMT。ZjOMT编码序列为1080bp,编码蛋白序列包含359个氨基酸。铝胁迫下,ZjOMT在叶和根中的表达量上调可达20.86倍和31.18倍。(3)日本结缕草ZjOMT基因功能研究将ZjOMT蛋白基因在大肠杆菌中进行表达,大肠杆菌的褪黑素合成能力提高了8倍,并且重组载体的铝抗性显著提高。将ZjOMT基因进一步转入拟南芥中进行过量表达,转基因植株的褪黑素含量明显上升,3个过量表达ZjOMT基因的转基因拟南芥株系褪黑素含量最高达72 ng/g,为野生型的4.0倍。另外两个株系也分别高达3.2倍和2.7倍。转基因植株的根长在200μM氯化铝胁迫下比对照分别减少了 20%、35%和37%,而野生型的根伸长减少60%,野生型拟南芥遭受氯化铝毒害,根长仅为过量表达ZjOMT基因株系的57-78%,转基因株系在200 μM氯化铝胁迫下MDA含量分别为野生型含量的81.1%、73.5%、64.4%,过量表达ZjOMT基因的拟南芥抗铝性显著提高。ZjOMT基因的表达可以提高植物褪黑素含量,进而提高抗铝毒能力,ZjOMT既可以作为提高作物褪黑素含量的候选基因,也可作为植物抗铝毒基因工程的基因资源。
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S688.4
【图文】：

生理生化分析,日本结缕草,铝胁迫,图数

逑ｍｇ／ｋｇ，ＭＤＡ含量、ＣＡＴ和ＰＯＤ酶活力显著高于对照，达到极显著水平（Ｐ＜０．０１），逡逑叶绿素含量虽有下降但未达极显著水平（图２－１）。逡逑豸邋３１逦１５－１逦Ｂ逡逑§逦＞逦ＡＢ逡逑ｆ邋２＇４＇邋Ｔ邋Ｔ邋Ｔ邋Ａ邋Ａ逦１２＇邋Ａ邋Ａ逦＾邋Ｉ逡逑—邋ｉ邋＃逦Ｔ邋ｒ邋Ａ逦0邋Ｔ邋Ｔ邋Ａ邋Ｉ逡逑Ｉ逦１．８－上逦ｉ逦N逦Ｉ逦Ｉ逦Ｅ逦９．邋ｉ邋N邋＊逡逑１逦ｉ逡逑２逦１．２．逦｜逦６－逡逑Ｉ逦８逡逑！逦０．６－逦ｇ逦３＿逡逑５逦２逡逑０逦逦ｙ逦邋■逦：邋．：■逦ｋ逦．．．．．：－逦＾逦．：逦，逦：逦．逦■逦Ｑ逦＾逡逑０逦２０逦４０逦６０逦８０逦１００逦０逦２０逦４０逦６０逦８０逦１００逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｌ＞邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋（ｍｇ／ｋｇ邋ｓｏｉｌ）逦Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ａｂ－＊－邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋（ｍｇ／ｋｇ邋ｓｏｉｌ）逡逑Ｓ＇逦６００－ｊ逦５逦１６５００逦！逡逑ｉ逦ｕ．逦Ｂ逡逑Ｏ）逦ｇ逦0ｉ逦丫逡逑塞逦５６０邋－逦Ｉ逦１３２００逦－邋？邋N逡逑ＡＢ逦ｉ逦１逦Ａ逦ａ逦Ａ逡逑Ｉ逦５２°＊逦Ａ逦Ａ逦Ａ逦＾逦Ｉ逦｜逦＂°°－逦ｔ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑＜ｉ逦Ｔ逦：暴逦ｍ逦＿逦呡逦＜３逡逑５邋４８０邋－上邋＊逦５逦６６００邋－逡逑＾逦Ｓ逡逑ｆ邋４４０邋－逦ｆ邋３３００－逡逑导逦１逡逑ｈ－邋４００逦逦逦逦逦．逦．逦，逦．邋Ｑ邋０－１逦，逦，逦，逦，逦，逦

散点图,散点图,铝胁迫,日本结缕草

我们利用ＦＤＲ与ｌｏｇ２ＦＣ来筛选差异基因，筛选条件为ＦＤＲ＜０．０５且ｌ0ｇ２ＦＣ＞ｌ，逡逑经过铝胁迫处理后，发现差异基因丨４，５５５个，上调的有９，７１０个，下调基因４，８４５个，逡逑（图２－２）。通过铝胁迫处理和对照之间的分析和比较，部分基因表达发生了变化，逡逑正因为这些基因的差异表达赋予了日本结缕草铝胁迫的抗性。逡逑Ｓｃａｔｔｅｒ邋ｐｌｏｔ逡逑ｐｅａｒｓｏｎ邋ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ：邋０．７１６逡逑？逦ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ｇｅｎｅｓ邋（９７１０）逡逑＿邋ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ｇｅｎｅｓ邋（４８４５）逦＃邋■暴逡逑0邋？邋ｎｏｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋（２０１８８）逦＾逡逑ｒ逡逑？逦％邋？邋？逡逑ＣＯ逡逑９）逡逑产逦Ｌ＂！逦１逦１逦１逦逡逑１0－０３逦１ｅ－０１逦１？＋０１逦１ｅ＋０３逡逑Ｖａｌｕｅ邋ｏｆ邋ＣＫ逡逑图２－２差异基因散点图逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｓｃａｔｔｅｒ邋ｐｌｏｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｇｅｎｅｓ逡逑表２－３列举了邋９９４个新基因中的１６个表达量较高的差异表达基因，铝胁迫处理逡逑３１逡逑

差异表达基因,基因,铝胁迫

我们选取了邋４个下调已注释基因、４个上调已注释基因和４个未注析基因共１２逡逑个基因对铝胁迫后不同时间段进行了邋ｑ－ＰＣＲ荧光定量分析，其结果与转录组测序结逡逑果相一致（图２－５）。其中两基因Ｆ调表达后有所逡逑回升似／ｖｅ邋ｆｒａｒａｃｎ冲基因下调较明显，而逡逑基因下调趋势较缓。上调己注释基因中，过氧化物酶（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ）、应激诱导蛋白逡逑（ｓｔｒｅｓｓ邋ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ）、锌指蛋白（ｚｉｎｃ邋ｆｉｎｇｅｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎ）基因基本逐步上调，而逡逑基因先升后降最终略高于未处理。新基因中跟水解酶相关的逡逑ＸＬＯＣ＿０００３６５、与阳离子结合相关的ＸＬＯＣ＿００６０７３都逐渐下调，与金属离子结合的逡逑ＸＬＯＣ＿０１０５４０基因稳步上调，而与金属簇结合相关的ＸＬＯＣ＿０３７４８６基因先上调后逡逑缓慢回落。在铝胁迫植物的整个过程中，许许多多基因参与其中，其表达模式也多种逡逑多样，有的在作用通路中形成负反馈调节，与其他基因共同形成动态平衡，无论基因逡逑的表达模式如何

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