低温胁迫下番茄中CI-HSP17.7的功能研究

发布时间：2020-07-11 02:18

【摘要】：番茄是世界上最重要的经济作物之一,因为其果实多层次的口感和丰富的营养元素深受大家的欢迎。但番茄作为喜温性茄果类,一旦遭遇低温胁迫就会造成品质受损、产量下降等伤害,带给种植者不可估量的经济损失。小热激蛋白(small heat shock proteins,sHSP),是一类植物遭受高温、低温、盐碱、机械损伤等生物、非生物胁迫时产生的能够对植物起到保护作用的蛋白。sHSPs不仅在热胁迫等逆境下具有保护细胞的分子伴侣属性,而且一些sHSPs在果实发育、冷藏期间以及冷藏后的恢复过程起重要作用,但sHSPs在果实发育中的确切作用及耐冷的分子机制目前还不清楚。本研究以阐明定位在细胞质中的ClassI小热激蛋白17.7(ClassI small heat shock protein 17.7,CI-HSP17.7)基因在低温胁迫下的功能为研究目标,通过对耐低温型克梅留斯基番茄(Solanum chmielewskii)和低温敏感型Moneymaker番茄果实成熟时期CI-HSP17.7的表达特点分析,进一步构建CI-HSP17.7基因的RNA干扰载体和过表达载体,并进行遗传转化及转基因植株的表型鉴定,主要研究结果如下:1)采用实时定量PCR技术分析CI-HSP17.7在两种糖积累型番茄中的表达差异,结果显示:在蔗糖积累型克梅留斯基番茄绿熟时期、己糖积累型Moneymaker番茄转色时期表达量最高。2)利用Gateway技术将PCR产物与中间载体pENTR/D-TOPO连接形成pENTR/D-TOPO-CI-HSP17.7载体,检测正确后将pENTR/D-TOPO-CI-HSP17.7载体与最终载体体pB7GWIWG2(I)进行LR反应,然后转化大肠杆菌和农杆菌,测序成功后得到CI-HSP17.7沉默载体。利用农杆菌介导的叶盘转化法建立克梅留斯基沉默遗传转化体系,经过鉴定获得阳性转基因株系即RNAi株系70株。利用限制性内切酶BgIII和BstEII构建过表达载体pCAMBIA3301-CI-HSP17.7,然后进行农杆菌转化。利用农杆菌介导的叶盘转化法建立Moneymaker番茄过表达遗传转化体系,经过鉴定获得阳性转基因植株即OE株系55株。3)分别取30个相同时期的转基因果实和正常果实,进行果实横径和纵径的测量,与对照组相比RNAi果实的横径、纵径、重量都有明显的减少,而OE果实与对照组相比横径、纵径、和重量有小幅度上升。4)通过对低温处理下两组果实中CI-HSP17.7基因表达量分析可知:当对正常果实进行低温处理时,果实中CI-HSP17.7基因含量会增加并且随着处理时间的增加会有上升的趋势,对于RNAi果实来说CI-HSP17.7基因表达量不仅比正常果实低而且在遭遇低温时表达量改变不大,而对于OE果实来说其CI-HSP17.7基因表达量比正常果实高而且在遭遇低温处理后表达量上升趋势更加明显。这说明低温可以诱导CI-HSP17.7基因含量的上升。5)低温处理克梅留斯基番茄后,正常果实中三种可溶性糖含量变化明显,其中蔗糖含量明显上升而果糖葡萄糖含量明显下降,说明克梅留斯基番茄通过积累蔗糖来抵抗低温胁迫。RNAi果实三种可溶性糖含量对比于正常果实下降明显。低温处理后RNAi果实,三种可溶性糖含量对比于正常果实下降明显但是低温处理后变化趋势不明显,蔗糖没有积累过程。这说明RNAi番茄耐低温性下降。OE番茄三种可溶性糖含量相比于对照组正常番茄都有所上升,低温处理下正常番茄果实果糖葡萄糖含量上升而蔗糖含量下降,这说明Moneymaker番茄通过积累果糖和葡萄糖来抵抗低温胁迫。而对于OE番茄低温处理后三种可溶性糖含多于正常果实,而且果糖和葡萄糖积累趋势更加明显,这说明OE番茄耐低温性增加。通过分析两组转基因番茄低温胁迫下糖含量的变化可以说明CI-HSP17.7基因对低温胁迫存在响应,CI-HSP17.7基因可能提高果实的耐寒性。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S641.2
【图文】：

结果与分析3 结果与分析3.1 CI-HSP17.7 基因在番茄果实成熟过程中的表达特点为了探究 CI-HSP17.7 基因在番茄果实成熟过程中的表达特点，我们在开花前 2 天、开花当天、开花后 7 天、14 天、21 天、果实绿熟时期、转色时期和完熟时期分别取样，然后提取样品的总 RNA，反转录后进行 qRT-PCR 检测(图 1，图 2)。如图 1 所示：以克梅留斯基番茄开花前 2 天状态中 CI-HSP17.7 基因表达量为对照，开花当天、花后 2 天、花后 7 天、14 天、21 天还有果实绿熟时期和完熟时期 CI-HSP17.7基因表达量跟对照相比都有显著提高，其中在绿熟时期和完熟时期表达量最高，相对对照上调了 100 倍和 53 倍。这说明 CI-HSP17.7 基因在克梅留斯基番茄果实发育的过程中表达量逐渐升高，其中在绿熟时期表达量最高。

图 2 Moneymaker 番茄果实成熟过程中的 CI-HSP17.7 相对表达水平Fig.2 The relative expression level of CI-HSP17.7 in Moneymaker tomato.BR，转色时期果实；RR，红熟时期果实。BR,break fruit; RR, red pipening.3.2 CI-HSP17.7 沉默载体的构建与检测3.2.1 CI-HSP17.7 cDNA 片段的获得根据已知的CI-HSP17.7 的cDNA全长，用RNA干扰原理设计出沉默引物，用引物S17.7-F和S17.7-R对CI-HSP17.7 沉默片段进行扩增，沉默片段在204bp-358bp之间片段大小为155bp。结果如图3所示：用琼脂糖凝胶检测已扩增出目的片段。

图 3 CI-HSP17.7 基因目的片段的 PCR 扩增电泳图Fig.3 Amplication of CI-HSP17.7 target fragment 扩增 CI-HSP17.7 基因目的片段；M：DL 1000 Marker(下同)；1、3： PCR CI-HSP17.7 扩SP17.7 gene amplification; M: DL 1000 DNA(The same as below); 1、3: PCR products of CI-H载体的构建及检测SP17.7沉默载体的构建采用Gateway技术，首先将CI-HSP17.7基因的间载体TOPO载体上，形成pENTR/D-TOPO-CI-HSP17.7载体，然后在反应进而转化到DH5α感受态上，经过筛选培养基筛选挑取单菌落。S17.7-R对CI-HSP17.7沉默载体进行菌液RCR检测。检测结果如下图出大小为155bp的条带。选取条带较亮的菌液进行测序，测序成功后行下一步将其转化成农杆菌。

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 Baruah，K．K,Medhi，A,陈德刚;水稻的生长和代谢对低温胁迫的反应[J];绵阳经济技术高等专科学校学报;1995年04期

2 张玄兵,夏春华,黄碧兰,刘芳;水杨酸对龙船花抗低温胁迫的影响[J];热带作物学报;2004年03期

3 刘旭梅;赵冰;申惠翡;徐静静;高晓宁;;低温胁迫下二十个杜鹃花品种的抗寒性评价[J];北方园艺;2017年05期

4 李杰;杨萍;颉建明;郁继华;;2,4-表油菜素内酯对低温胁迫下辣椒幼苗根系生长及抗氧化酶系统的影响[J];核农学报;2015年05期

5 祝国庆;沙勇龙;马小才;杨军;;低温胁迫对“西州密25号”幼苗叶片的生理变化[J];新疆农业科技;2018年03期

6 董铮;戴阳朔;李魏;戴良英;;水稻中耐低温胁迫的转录因子研究进展[J];湖南农业科学;2013年07期

7 唐仕云;杨丽涛;李杨瑞;;不同甘蔗基因型对低温胁迫的响应及其耐寒性评价[J];热带作物学报;2012年04期

8 解凡;赵丽丽;叶丽云;吴小平;;肺形侧耳低温胁迫时期的转录组分析[J];菌物学报;2018年12期

9 李莎莎;;植物低温胁迫生理研究进展[J];科技经济导刊;2017年17期

10 杨慧芹;王莎莎;张建波;郝大海;马文广;逄涛;龚明;;烟草多酚代谢对干旱和低温胁迫的响应差异及其比较[J];基因组学与应用生物学;2015年03期

相关会议论文 前10条

1 严顺平;汤章城;苏维埃;孙卫宁;;水稻响应低温胁迫的蛋白质组研究[A];2006中国植物细胞发育与分子生物学学术研讨会论文集[C];2006年

2 金静静;张慧;张剑锋;刘萍萍;陈霞;李泽锋;许亚龙;卢鹏;曹培健;;烟草低温胁迫下的转录组和代谢组整合分析[A];“农业健康与环境”组学大数据整合生物信息学研讨会论文集[C];2017年

3 高利英;邓永胜;韩宗福;孔凡金;申贵芳;李汝忠;;不同棉花品种种子萌发期对低温胁迫的响应[A];2018年山东作物学会学术年会论文集[C];2018年

4 肖浏骏;刘蕾蕾;曹卫星;朱艳;;我国冬小麦主产区拔节后低温胁迫的时空变化规律及其对产量的影响[A];中国作物学会2013年学术年会论文摘要集[C];2013年

5 王丽燕;孟庆伟;;抑制GDP-L-半乳糖磷酸酶基因(S/GGP)的表达降低番茄抵抗低温胁迫的能力[A];山东植物生理学会第七次代表大会暨植物生物学与现代农业研讨会论文集[C];2012年

6 吴锦程;梁杰;陈建琴;刘美琼;陈丽钦;杨伟搏;吴晶晶;;SA对低温胁迫后枇杷幼果AsA-GSH循环的影响[A];庆祝中国园艺学会创建80周年暨第11次全国会员代表大会论文摘要集[C];2009年

7 韩菡;高珊;杨莎;李滨;杨兴洪;孟庆伟;;低温胁迫下番茄玉米黄质环氧化酶基因的表达和功能研究[A];中国植物生理学会第十次会员代表大会暨全国学术年会论文摘要汇编[C];2009年

8 马艳青;戴雄泽;;低温胁迫对辣椒抗寒性相关生理指标的影响[A];中国园艺学会第四届青年学术讨论会论文集[C];2000年

9 韩娜妮;范舒雅;郭佳;;低温胁迫下番茄SlHY5的作用[A];中国园艺学会2019年学术年会暨成立90周年纪念大会论文摘要集[C];2019年

10 魏珉;马红;于贤昌;李滨;;低温胁迫影响厚皮甜瓜幼苗生育的初步研究[A];中国科协第3届青年学术年会园艺学卫星会议暨中国园艺学会第2届青年学术讨论会论文集[C];1998年

相关重要报纸文章 前2条

1 中国农业科学院植物保护研究所研究员 袁会珠;种衣剂研发与应用中如何应对低温胁迫[N];农民日报;2016年

2 中国农业科学院植物保护研究所研究员 袁会珠;种衣剂研发与应用中如何应对低温胁迫[N];河南科技报;2016年

相关博士学位论文 前10条

1 王琼珊;棉花响应高低温胁迫MicroRNAs的鉴定及GhKCS13对低温敏感性的调控[D];华中农业大学;2017年

2 王q

本文编号：2749817