PDC和ADH在采后柑橘果实乙醛乙醇积累中的作用

发布时间：2020-07-12 01:15

【摘要】：柑橘是我国重要的日常水果,市场上常采用贮藏的方式来延长柑橘供应期。然而在贮藏期间,柑橘果实不仅风味变淡,还积累异味物质乙醛和乙醇,食用价值大大降低,严重影响消费者体验。为此,就不同柑橘品种果实乙醛、乙醇积累差异以及温度和涂蜡对普通i*柑果实乙醛、乙醇积累的影响开展了研究,主要结果如下:1.为解决紫外法和氮蓝四唑法无法准确测定部分样品乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)活性的问题,建立了一种基于3-甲基-2-苯并噻唑腙(3-methyl-2-benzothiazole hydrazine,MBTH)的ADH酶活性测定方法。该法采用HC1终止酶反应,反应时间可控,配合酶标板可实现样品批量测定,且在灵敏度和准确度方面均优于紫外法和氮蓝四唑法。2.从公开的柑橘基因组数据中鉴别出14个ADH和2个PDC(pyruvate decarboxylase,丙酮酸脱羧酶)家族成员,并基于2个甜橙果肉转录组数据确定了在果肉中表达较强的6个AADH成员和2个PDC成员。3.以7种宽皮柑橘、5种甜橙、1种杂柑和3种柚共4个大类16个柑橘品种为实验材料开展了贮藏试验,对果实中乙醛和乙醇积累的品种间差异进行了研究。发现不同种类柑橘在乙醛、乙醇含量上有所差异,采收期果实相差幅度达20.8倍和61.1倍。大多数柑橘贮藏期间乙醛、乙醇含量升高,如普通i*柑贮藏60 d时乙醛和乙醇含量分别是0 d时的8.8倍和48.7倍,但冰糖橙和玉环柚在贮藏期间乙醛和乙醇含量变化不大(增加幅度不超过1倍甚至降低)。ADH酶活性在品种间差异高达201.5倍左右(采收期果实),大多在贮藏期间趋于上升(广橙除外)。ADH1表达在多数柑橘中随贮藏增强,而AADH2和ADH3仅在个别柑橘贮藏60 d时表达增强。PDC活性在品种间也存在差异,采收期果实相差幅度高达6.7倍,但酶活性在贮藏期间变化不大。PDC1和PDC2表达在不同柑橘品种间以及贮藏期间的变化幅度也较小,大多不超过1倍。乙醛和乙醇含量、ADH和PDC酶活性、ADH和PDC各成员表达之间的相关性分析表明PDC酶活性和基因表达与乙醛、乙醇积累密切相关,而ADH酶活性与乙醛和乙醇积累相关性较弱,表明PDC可能是调控柑橘采后果实乙醛和乙醇积累的限制因子。4.为进一步探讨ADH和PDC在乙醛、乙醇积累中的作用,比较了不同温度贮藏和涂蜡处理的效应。研究表明,低温下(5℃)普通碰柑在贮藏初期乙醛、乙醇含量虽呈上升趋势,但增势较缓,且含量始终低于15℃下贮藏的i*柑,然而在90 d时乙醇含量增至与15℃下接近而乙醛含量则高于15℃下,伴有ADH和PDC表达高于15℃果实,但ADH酶和PDC酶活性略低于15℃。就i*柑而言,ADH酶活性与乙醛含量相关性可达0.9以上。涂蜡处理后普通碰柑果实中乙醛和乙醇随贮藏不断积累,后期一直高于对照,伴有高于对照的ADH和PDC酶活性以及基因表达。ADH酶和PDC酶活性分别与乙醛和乙醇含量高度相关。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S666
【图文】：

显色反应,稳定时间

２．２．２显色反应的稳定时间逡逑选取了乙醛标准溶液中的任意三个浓度（浓度高低依次为Ａ＜Ｂ＜Ｃ）对显逡逑色反应的稳定时间进行了分析。由实验结果图２．１我们可以看出，不同浓度的乙逡逑醛溶液在显色反应后的１２邋ｈ内均能够保持较高的稳定性（Ａ／Ａ0＞邋８５％），但浓度逡逑越高，显色稳定性下降。而在实际实验中，也没有过夜放置的需求和必要，因而逡逑在显色反应后１邋ｈ内进行检测是一个比较宽裕且合适的选择（Ａ／Ａ0＞邋９９％）。逡逑；Ｍａ￣逡逑０逦０．５逦１逦２逦４逦６逦８逦１０逦１２逡逑Ｔｉｍｅ邋（ｈ）逡逑图２．１显色反应稳定时间分析逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋Ｃｏｌｏｒ－ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｓｔａｂｉｌｉｔｙ邋ｔｉｍｅ邋ａｎａｌｙｓｉｓ逡逑２．２．３反应时间确定逡逑为确定不同方法的最佳反应时间，我们取同一样品，分别用三种方法分析。逡逑ＵＶ法在启动反应后的第０、１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０邋ｍｉｎ分别测定Ａｍｏ；逡逑ＮＢＴ邋法在开始孵育的第邋５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０邋ｍｉｎ逡逑分别测定Ａ５９０；邋ＭＢＴＨ法则在开始酶反应后的０、１５、３０、６０、９０、１２０邋ｍｉｎ加逡逑入ＭＢＴＨ盐酸溶液终止反应，经显色反应后分别测定八６１0。逡逑１２逡逑

反应时间,过长,显色,重复性

可以看到在ＵＶ法中两个明显的转折点，分别是第５邋ｍｉｎ和第２０ｍｉｎ处（图逡逑２．２Ａ），因而该方法最佳的测定时间应当设定在５邋ｍｉｎ。而ＮＢＴ法，整体呈现出逡逑头重脚轻的Ｓ型曲线（图２．２Ｂ）。在最初避光孵育时间不足时，吸光度的增长稍逡逑慢，但适当时间的孵育后，能够呈现出较好的趋势（１５－３０ｍｉｎ），而时间过长时逡逑显色物质不够稳定而导致吸光度反而有所下降，故选定２０邋ｍｉｎ最为该方法的最逡逑佳测定点。与ＮＢＴ法的边反应边测定相比，ＭＢＴＨ先反应后测定，避免了显色逡逑物质不稳定带来的测定问题，但也出现反应时间过长（超过３０邋ｍｉｎ）时产物并不逡逑线性增加的情况，故设定３０邋ｍｉｎ为最佳时间点（图２．２邋Ｃ）。逡逑Ａ逦Ｂ逦Ｃ逡逑ＯＴ逦１．６逦１．Ｓ邋？逡逑Ｉ０４＇逦１0－８．逦／逦１0９－邋Ｚ逡逑７逦：：：／逡逑０逦逦．逦．逦；—逦０逦￣￣Ｉ逦逦逦逦逦逦逦．逦．—逦0邋Ｙ－逦．逦１逦１逦：逦逦逦ｒ－逡逑０逦１０逦２０逦？０逦Ｃ邋２５逦３０逦４５逦６０逦７５逦９０逦０逦２０逦４０逦６０逦８０逦１００逦１２０逡逑Ｔｉｍｅ邋Ｃｍｌｎ）逦Ｔｉｍｅ邋Ｃｗｌｎ）逦Ｔｉｍｅ邋（ｍｉｎ）逡逑图２．２三种方法反应时间确定逡逑Ａ：邋ＵＶ；邋Ｂ：邋ＮＢＴ；邋Ｃ：邋ＭＢＴＨ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．２邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｉｍｅ－ｃｏｕｒｓｅ逡逑Ａ：邋ＵＶ；邋Ｂ：邋ＮＢＴ；邋Ｃ：邋ＭＢＴＨ逡逑２．２．４重复性分析逡逑为比较三种方法的重复性优良，我们取柚（t/溪蜜柚，记为样品Ａ）、甜橙逡逑（纽荷尔脐橙

系统发育进化树,柑橘,结合区

但高度保守，均含有中链脱氢酶的三种特征序列：Ｚｎｌ结合区、Ｚｎ２结逡逑合区和辅酶结合区（Ｊｉｎ等，２０１６）。甜橙ＰＤＣ基因仅有两个，其中逡逑与ＣＷ７ＰＤＣ２亲缘关系较近，而ＣｓＰＤＣ２与较同源（图３．２邋）。两个ＣｓＰＺ）Ｃ逡逑基因同源性可徸８２°／0，与拟南芥NBｒ／ＷＣ？、的同源性也均在８１％及以上。逡逑对ＣｓｌＤ／／和ＣｓＰＤＣ的亚细胞预测结果显示，１４个ＣＭＤ／／可能仅位于细胞质中，逡逑而ＣｘＰＤＣ则既定位于细胞核中也定位于细胞质中。逡逑１９逡逑

【参考文献】