梨锈水病菌的分子检测技术研究及丁香假单胞菌黄瓜株系和甜瓜株系的碳源利用比较

发布时间：2020-07-13 13:32

【摘要】：梨锈水病是一种由细菌引起的病害,1973年在江苏省北部区域,部分梨树出现了主干流出铁锈色的粘性液体的病症,发病梨树轻则落叶减产重则整株枯死,给果农带来了巨大的经济损失。经采样分析后发现这是一种从未被报道过的细菌病害。发病梨树的主要症状主要是在枝干上产生带有酒糟气味的铁锈色粘液,故而取名“梨锈水病”,近年来梨锈水病在浙江、山东、德州也时常发生。经本实验室鉴定,梨锈水病原菌为迪基氏茵(Dickeya)属下的一个未报道的种,本实验室将其命名为方中达迪基氏菌D.fangzhongdaisp.nov.。在植物检疫方面,梨锈水病的发病症状与检疫性病害梨枯枝病类似,通过传统的检测技术难以区分。并且由于梨锈水病原菌是一种新的病原菌,目前国内还没有建立对其的分子检测技术,因此本实验旨在通过普通PCR、实时荧光定量PCR的方法,建立梨锈水病原菌的分子检测方法,能够对梨锈水病菌进行快速准确的检测,对病害的防治做出有益贡献。首先,本研究利用生物信息学技术中的Blast比对方法将梨锈水病原菌与其他13种近缘菌进行全基因组对比,筛选出10个具有特异性位点的同源基因,并针对这些具有特异性位点的基因片段设计引物,进行PCR扩增验证。其次,对于10对设计好的引物进行PCR的验证,筛选出两对特异性强、灵敏度高的引物,分别是根据胞外多糖基因cpsB以及hrp基因簇hrpV基因设计的特异性引物。这两对引物只能扩增梨锈水菌的特异性片段,对其属内的其他菌种及部分远缘细菌均无条带生成说明其高度的特异性,并且灵敏度可达10 pg/μL。以此建立了梨锈水病的PCR的检测方法。最后,设计了以同源基因hrpV同源基因为靶标的特异性TaqMan探针和引物,建立了梨锈水病原菌的实时荧光定量检测方法。检测灵敏度可达20copies/μL,是普通PCR检测方法的100倍,在一个小时内就可以完成检测。本研究建立的普通PCR检测方法方便快捷,且成本低廉。荧光定量PCR方法灵敏度更高,用时更短,二者均能较好地将梨锈水病菌和其他迪基氏菌种区分,填补了梨锈水病分子检测的空白,为检测梨锈水病提供了新的方法。丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)引起的黄瓜细菌性角斑病在世界范围内皆有发生,造成不同程度的损失,同时也引起甜瓜细菌性叶斑病。以往研究表明黄瓜和甜瓜细菌性角斑病的病原均为丁香假单胞菌黄瓜致病变种,但在本实验室的研究中发现,丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系和甜瓜株系在致病性和分子生物学上存在一定差异。本研究利用Biolog细菌鉴定系统对黄瓜细菌性角斑病菌黄瓜株系和甜瓜株系的碳代谢活力分别进行了测定与比较。结果发现,丁香假单胞菌黄瓜株系和甜瓜株系属于不同的基因种。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.612.1
【图文】：

反应原理

会发射荧光信号，通过监测荧光信号便能知道目的产物的生成量。第二种是ＲｇＭａｎ探针法，这种方法是建立在荧光共振能量转移原理上的（Ｃｌｅｇｇ，邋１９９５）。这种方法的心是设计一条特异的荧光探针，荧光探针是一条含有特异性位点的２０－３０ｂｐ的寡核酸，其退火温度略高于引物，在探针的５’端添加报告荧光基团，３’端添加淬灭荧基团。当反应开始时，；Ｔ＾Ｍａｎ探针是完整的，探针５’端添加的荧光基团发射的荧信号被３’端的淬灭荧光基团吸收，此时没有荧光信号的产生。在反应进行过程中７１＾酶会水解ｒ＾Ｍａｎ探针，使得报告荧光基团游离在体系之中，淬灭荧光基团无法吸其发出的荧光信号，此时仪器便能实时监测到反应中的荧光信号。两种实时荧光定ＰＣＲ的方法各有利弊，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ邋Ｉ法成本较低，但耗时较长，７ｌ＾Ｍａｎ探针法的光探针制作成本较高，还有添加ＭＧＢ基团以增加热稳定性的７ｉ＾Ｍａｎ邋ＭＧＢ探针，往往在一个小时内就能完成检测，目前此方法在植物检测病害方面也得到了许多应逡逑用。初次将荧光定量ＰＣＲ方法引入应用于植物病害检测领域的是Ｂｏｈｍ等（１９９９），邋２００年有学者首次运用荧光定量ＰＣＲ方法检测了真菌植物病害（Ｒｅｉｄ，２０００）。在中国，运逡逑用荧光定量技术对对植物病原微生物进行定量分析的时间还不长，程颖慧等（２００２）立了小麦印度腥黑穗病菌的实时荧光定量检测技术。逡逑ＴａｑＩＶｌａｎ＇＊逦＿逡逑＇

锁式探针,黄冠

３．２锁式探针技术（Ｐａｄｌｏｃｋ）逡逑环状寡核苷酸探针即锁式探针，己经证明在基因检测中有广泛的应用价值，包括逡逑原位分析、基因分型和基因表达的测量等（Ａｎｔｓｏｎ，邋２０００）。琐式探针检测技术是一种以逡逑连接酶介导的分子检测技术（Ｎｉｌｓｓｏｎ邋ｅｔａｌ．，邋１９９４）。锁式探针（ＰＬＰｓ）是一段长的核苷酸逡逑链，探针的末端与目标序列互补。在与目标序列杂交后，探针的两端接触，通过连接逡逑使探针环化。探针有非常特异的靶标识别位点，紧接着的是普通的ＰＣＲ扩增和斑点逡逑杂交（Ｓｚｅｍｅｓ，２００５）。成环的探针会在ＰＣＲ中被成倍扩增，斑点杂交后会出现颜色反逡逑应，而未能与目标基因配对的探针会被外切酶降解。以此可以判断待测样品中是否存逡逑在目标病原菌。锁式探针技术最大的优点是可以检测出单碱基的差异，大大减轻了探逡逑针与引物设计的难度，而且其灵敏度也较高。刘达等（２０１３）利用琐式探针技术检测瓜逡逑蔓枯病菌，检测灵敏度可达２００邋ｆｇ是常规ＰＣＲ检测灵敏度的１００倍，完全满足了曰逡逑常检疫工作中的要求。陈艳鸿等（２０１５）以ＤＮＡ复制和修复蛋白基因为靶标，建立了基逡逑于锁式探针结合正向斑点杂交技术的地毯草黄单胞菌大豆致病变种检测体系检测灵逡逑敏度达到ｌＯＯｆｇ／ｐＬ。逡逑

反应原理,嗜酸菌

逦梨锈水病的分子检测技术研究逦逡逑光显色即可完成检测。其检测灵敏度为２０邋ｃｆｏ／ｍＬ。该方法为西瓜嗜酸菌的检疫及其逡逑所致病害的快速诊断提供了新的技术。逡逑

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