枇杷突变材料转录组分析及EjSWEET15和EjAO基因的挖掘
发布时间：2020-07-15 00:55
【摘要】：枇杷属蔷薇科(Rosaceae)枇杷属(Eriobotrya Lindley),是起源于我国的特色水果,具有极高的医疗保健价值。根据果肉颜色不同分为红肉枇杷和白肉枇杷,红肉枇杷果实带有橙色,果肉较紧密,果皮较厚,较耐贮运,抗逆性强;白肉枇杷果肉乳白色或淡黄色,肉质细嫩、汁多味甜,因其风味好、口感佳而更受消费者青睐。除果肉颜色外,两类枇杷果实在糖分积累,纤维素含量,口感风味也存在显著差异。迄今,枇杷基因组背景尚不清楚,与枇杷果实品质性状相关的基因鉴定鲜有研究报道。本研究以红肉枇杷及其白肉突变体枇杷为材料,通过RNA-Seq技术全面分析了两种果实间的转录水平上的差异,在此基础上开发了差异基因的EST-SSR标记和SNP位点,并利用RACE和RT-PCR技术克隆了两个与枇杷果肉品质相关基因EjSWEET15和EjAO基因,并对这两个基因进行了生物信息学分析,为枇杷果实品质形成、种质鉴定、遗传图谱构建、基因定位及克隆和分子标记辅助选择育种等研究奠定了理论基础。具体研究成果如下:1、本研究对野生型红肉枇杷和突变型白肉枇杷在果实转色至成熟间的4个时期(盛花期后171d、175d、180d、185d)样本进行转录组测序。除去低质量数据后共得到约9.5Gb的Clean reads,组装出61 587条Unigenes(已被上传到NCBI的Sequence Read Archive 数据库中,登陆号为:SUB919374)。在阈值为|log2Ratio|≥1和probability0.8时,共检测到28 216个Unigenes(13 676个上调和14 540个下调)差异表达。Gene Ontology(GO)和KEGG分析表明有40个GO类别和121代谢通路显著富集,涉及次级代谢物合成、植物激素信号传导、氧化磷酸化、糖酵解、淀粉与蔗糖代谢、氨基糖与核糖代谢等。此外还从中鉴定出21个与类胡萝卜素代谢相关的基因,大部分基因在盛花期后171d时在红肉枇杷果肉中的表达量要显著高于白肉枇杷。2、利用MISA软件从野生型红肉枇杷和突变型白肉枇杷在果实转录组组装数据筛选的6608个Unigenes中共分析得到7606个EST-SSR序列。根据退火温度,扩增产物大小等指标,随机选择250对合成引物对野生型红肉枇杷、突变型白肉枇杷基因组进行扩增,结果有226对扩增出清晰条带,扩增效率为90.4%。可见,通过枇杷果实转录组数据平台,发掘到可用的EST-SSR标记的效率很高。3、通过GATK软件对枇杷果实转录组全长组装序列分析,在1361个Unigenes中发现2396个SNPs位点,主要突变类型是AT突变成GC(768个),其次是GC突变成AT(726个)的碱基转换,碱基转换突变频率是碱基颠换的1.65倍。SNP在Unigenes中出现频率为2.2%,且大部分(约87%)SNPs是无义突变,有311个SNPs是错义突变。并从3个候选基因中发现了 11个SNPs与枇杷类胡萝卜素合成有关,其中至少有一个SNPs是错义突变造成编码的氨基酸发生改变。4、SWEET蛋白是近年来在真核生物中发现的一类糖转运蛋白,具有2个典型的MtN3/saliva结构域。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和RT-PCR相结合的方法,从白肉枇杷成熟期果实中成功克隆到一个编码SWEET蛋白的基因,命名为EjSWEET15。该基因全长1 271 bp,包含了长度为918 bp的开放阅读框。该阅读框编码的氨基酸数目为305个,所形成的蛋白质预测分子量为34.13 kDa。实时荧光定量PCR结果显示EjSWEET15在叶片和果实中高丰度表达,并且在白肉枇杷成熟期果实中的表达量远远高于红肉枇杷。核苷酸多态性分析显示EjSWEET15基因在红肉枇杷和白肉枇杷共有4处多态性位点,其中1处位于启动子区域,其余3处均位于开放阅读框内,且均造成氨基酸发生改变,推测可能对EjSWEET15的酶学活性产生影响。EjSWEET15的克隆和多态性位点的鉴定为阐明枇杷果实品质形成机制及枇杷遗传改良育种提供一定的理论依据。5、果实的成熟和衰老是个复杂的生物学过程,一般认为活性氧(ROS)在其中起着重要作用。本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和RT-PCR相结合的方法,从白肉枇杷成熟期果实中成功克隆到一个编码抗坏血酸氧化酶(AO)的基因,命名为EjAO。该基因全长2 174 bp,包含了长度为1 605 bp的开放阅读框。该阅读框编码的氨基酸数目为534个,所形成的蛋白质预测分子量为59.39 kDa。实时荧光定量PCR结果显示EjAO在根和果实中高丰度表达,并且在白肉枇杷成熟期果实中的表达量远远高于红肉枇杷。核苷酸多态性分析显示EjAO基因在红肉枇杷和白肉枇杷共有五处多态性位点,其中T719C和A730C均导致氨基酸发生改变,推测可能对EjAO的酶学活性产生影响。EjAO的克隆和多态性位点的鉴定为阐明枇杷果实成熟与衰老机制及枇杷遗传改良育种提供了一定理论依据。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S667.3
【图文】：
是制约枇杷种类和果实品质口感的限制因素，红白两类枇杷除果肉颜色差异外，含逡逑糖量、维生素Ｃ含量、耐贮性等也是果实品质的重要指标。本项目组在前期研究中逡逑发现了一株洞庭枇杷突变体材料（见图１－１和图１－２），该植株野生型果实是红肉枇逡逑杷，仅在树千中间部位出现一枝芽变，芽变枝结出白肉枇杷果实，这为枇杷果实品逡逑质生物学研宄提供了宝贵素材。通过前期的研宄发现，相对于野生型红肉枇杷，突逡逑变型白肉枇杷果实成熟期稍晚５？７天，果型外观较圆，纤维素和类胡萝卜素含量极逡逑低，果糖和蔗糖含量分别高出野生型１４．９％和９０．９％，相对甜度高出跹生型２４．５％；逡逑维生素Ｃ含量基本一致。为全面发掘与枇杷果实品质相关的基因差异，本研宄拟利逡逑用ＲＮＡ－ｓｅｑ对该野生型和突变型果实于盛花期后第１７１ｄ、１７５ｄ、１８０ｄ、１８５ｄ进行逡逑转录组测序分析，系统挖掘与两类枇杷果实品质相关的表达差异基因，开发枇杷果逡逑实品质性状相关的ＥＳＴ－ＳＳＲ和ＳＮＰ标记，为枇杷果实品质性状基因的发掘及其分逡逑１２逡逑
据此作为取样时间点计算依据；当年从果实转色到成熟分４个时期（盛花后Ｉ７１ｄ、逡逑１７５ｄ、１８０ｄ、１８５ｄ）分别取样。每次取样选择外观色泽、大小及成熟度均一的果实逡逑（见图２－１），立即去皮和核，果肉削块液氮冷冻处理后装入冷冻管－８０°Ｃ冰箱保存逡逑备用。逡逑每种实验选用混合果肉样品，ＲＮＡ－ｓｅｑ各选取三管进行上机实验；实时荧光定逡逑量ＰＣＲ检测及母Ｓ灰￡￡７７５和石基因克隆及表达分析均懫用成熟期１８５ｄ果肉混逡逑合样品开展。耳／５Ｗ￡￡７７５和／＾（０基因组织特异性表达分析选用长势一致的白肉突逡逑变枇杷一年生实生幼苗各二株，分别S胃⑹髌ぁ⒁叮梦掊姿逑春笾糜谝旱义媳４姹赣谩ｅ义希保跺义
本文编号：2755731
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S667.3
【图文】：
是制约枇杷种类和果实品质口感的限制因素，红白两类枇杷除果肉颜色差异外，含逡逑糖量、维生素Ｃ含量、耐贮性等也是果实品质的重要指标。本项目组在前期研究中逡逑发现了一株洞庭枇杷突变体材料（见图１－１和图１－２），该植株野生型果实是红肉枇逡逑杷，仅在树千中间部位出现一枝芽变，芽变枝结出白肉枇杷果实，这为枇杷果实品逡逑质生物学研宄提供了宝贵素材。通过前期的研宄发现，相对于野生型红肉枇杷，突逡逑变型白肉枇杷果实成熟期稍晚５？７天，果型外观较圆，纤维素和类胡萝卜素含量极逡逑低，果糖和蔗糖含量分别高出野生型１４．９％和９０．９％，相对甜度高出跹生型２４．５％；逡逑维生素Ｃ含量基本一致。为全面发掘与枇杷果实品质相关的基因差异，本研宄拟利逡逑用ＲＮＡ－ｓｅｑ对该野生型和突变型果实于盛花期后第１７１ｄ、１７５ｄ、１８０ｄ、１８５ｄ进行逡逑转录组测序分析，系统挖掘与两类枇杷果实品质相关的表达差异基因，开发枇杷果逡逑实品质性状相关的ＥＳＴ－ＳＳＲ和ＳＮＰ标记，为枇杷果实品质性状基因的发掘及其分逡逑１２逡逑
据此作为取样时间点计算依据；当年从果实转色到成熟分４个时期（盛花后Ｉ７１ｄ、逡逑１７５ｄ、１８０ｄ、１８５ｄ）分别取样。每次取样选择外观色泽、大小及成熟度均一的果实逡逑（见图２－１），立即去皮和核，果肉削块液氮冷冻处理后装入冷冻管－８０°Ｃ冰箱保存逡逑备用。逡逑每种实验选用混合果肉样品，ＲＮＡ－ｓｅｑ各选取三管进行上机实验；实时荧光定逡逑量ＰＣＲ检测及母Ｓ灰￡￡７７５和石基因克隆及表达分析均懫用成熟期１８５ｄ果肉混逡逑合样品开展。耳／５Ｗ￡￡７７５和／＾（０基因组织特异性表达分析选用长势一致的白肉突逡逑变枇杷一年生实生幼苗各二株，分别S胃⑹髌ぁ⒁叮梦掊姿逑春笾糜谝旱义媳４姹赣谩ｅ义希保跺义
本文编号：2755731
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/yylw/2755731.html
