柑橘致敏性评价方法建立及其引起人体不良反应机理研究
发布时间：2020-07-16 19:54
【摘要】：柑橘因其独特风味深受人们喜爱,是世界上最重要的水果之一。柑橘富含各种有益健康的功能性成分,消费者在享受这些功效的同时,也有部分人在食用柑橘时出现食物不良反应(上火、过敏等),症状表现为口舌生疮、喉咙红肿等,这种不适反应的感官体验也逐渐成为人们评价果实品质的指标之一。然而,由于相关的研究基础弱、研究条件要求高、需要多学科交叉等原因,柑橘摄入导致人体不良反应的研究进展缓慢。随着果树学、分子生物学、分析化学和医学等学科快速发展,交叉融合,温州蜜柑摄入导致人体“上火”这个消费者关注的科学问题重新提到研究日程上。本研究建立了低致敏性柑橘种质资源筛选方法,筛选低致敏性柑橘品种,可为过敏体质的特殊人群提供可食用的柑橘;然后评价了不同柑橘种类品种致敏性,探明过敏原蛋白积累规律,从柑橘过敏的角度解释温州蜜柑摄入诱导人体不良反应的原因;最后通过已建立的流行病学研究平台,结合柑橘过敏原研究,解析温州蜜柑摄入诱导人体不良反应症状的发生机理。主要研究结果如下:1.果实不同组织、成熟期和遗传因素对柑橘过敏基因表达的影响知之甚少。本研究发现甜橙(Citrus sinenesis)中过敏原基因Cit s 1.01、Cit s 2.01和Cit s 3.01分别有15、2和6个序列高度相似的同源基因,克隆了这3个过敏原基因,并设计了特异性Taqman探针,建立多重荧光定量PCR(Multiplex real-time PCR assay)的方法,能对甜橙过敏原基因进行绝对定量分析,且发现在柑橘成熟过程中过敏原基因Cit s1.01、Cit s 2.01和Cit s 3.01的表达模式不同。此外,10个柑橘品种(红橘、本地早、温州蜜柑国庆一号、纽荷尔脐橙、华盛顿脐橙、红肉脐橙、路德红夏橙、鸡尾葡萄柚、星路比葡萄柚)的果皮和果肉中Cit s 3.01基因表达量均比Cit s 1.01和Cit s 2.01基因高。此外,以高班柚(Citrus maxima)为代表的柚类过敏原基因表达水平较低。2.柑橘含有的过敏原,如Cit s 1.01、Cit s 2.01、Cit s 3.01,都可能导致过敏反应。本研究建立了这三个柑橘过敏原蛋白原核表达体系,能快速、大量地获得重组的三个柑橘过敏原,并利用表达纯化的过敏原蛋白作为抗原制备了特异性、灵敏的兔多克隆抗体Anti-Cit s 1.01、Anti-Cit s 2.01和Anti-Cit s 3.01。并且,本研究使用免疫印迹的方法对21个柑橘品种(红橘、本地早、鄂柑一号、克里曼丁橘、温州蜜柑国庆一号、纽荷尔脐橙、华盛顿脐橙、红肉脐橙、路德红夏橙、高班柚、晚白柚、沙田柚、t/溪蜜柚、鸡尾葡萄柚、星路比葡萄柚、尤力克柠檬、墨西哥莱蒙、融安金弹、清见、不知火、秋晖)的果皮、果肉中三个柑橘过敏原含量进行检测,通过印迹强弱来评价柑橘果实的致敏性,证明了柚(高班柚、晚白柚、沙田柚、t/溪蜜柚)中过敏原Cit s 1.01、Cit s 2.01、Cit s 3.01含量相对最低。此外,利用甜橙过敏人群血清进行免疫印迹分析进一步验证了沙田柚和t/溪蜜柚是8个柑橘品种(克里曼丁橘、国庆一号温州蜜柑、红肉脐橙、沙田柚、t/溪蜜柚、鸡尾葡萄柚、金柑和尤力克柠檬)中致敏性最低的。因此,柚类可作为低致敏柑橘品种供给过敏体质的特殊人群食用。3.连续3年重复进行食用温州蜜柑志愿者实验,发现过量食用温州蜜柑能引起食物不良反应,其症状为喉咙痒或喉咙痛、牙龈肿胀和口腔溃疡,这种现象在传统中医上称为“上火”。通过利用已建立的流行病学研究平台(即双盲安慰剂对照食物激发试验),发现食物摄入3天后,温州蜜柑组中72.7%的参与者出现SIS症状,但安慰剂组(甜橙组)中只有30%的参与者出现SIS症状。且通过临床症状观察统计分析,温州蜜柑诱导综合症(SIS)是一种免疫介导的食物不良反应,其症状特征在于呼吸道,胃肠道和口腔的不适,同时血清中炎症因子TNF-α和血红蛋白含量,以及嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和血小板的数量呈现显著性变化。因此,过量摄入新鲜的温州蜜柑可诱发炎症反应。利用血清代谢组学研究发现SIS症状发生的分子机制可能是通过影响花生四烯酸代谢途径,进而导致炎症。脂质代谢物PC(20:5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)/16:1(9Z))也被鉴定为SIS症状的潜在生物标志物。此外,比较温州蜜柑(Citrus unshiu)和甜橙中三种过敏原含量差异,我们发现柑橘过敏原不是引起SIS的关键原因。综上所述,本研究通过建立低致敏性柑橘种质资源筛选方法,鉴定了柚类是潜在的低致敏性柑橘品种;同时,发现柑橘过敏原不是温州蜜柑摄入诱导人体“上火”的原因;此外,通过对参与双盲安慰剂对照食物激发试验的人群血样进行代谢组学分析及数据挖掘,发现温州蜜柑是通过花生四烯酸代谢途径诱导人体的轻度炎症。本研究涉及的柑橘摄入导致人体不适反应症状的研究是提升柑橘果实品质的重要知识补充,能引导人们健康安全地消费柑橘。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S666
【图文】：
图 1-1 食物的不良反应类型(Boyce Joshua Aet al 2010)Figure 1-1. Types of adverse reactions to food (Boyce Joshua Aet al 2010)2.2 食物过敏反应的流行病学调查研究进展食物过敏反应是影响人类健康的因素之一，尤其是发达国家的患病率呈现逐年增加的趋势。在全球范围内，澳大利亚的食物过敏患病率最高，有 10%的婴儿对一种或多种食物过敏，而欧洲和美国等其他发达地区的患病率估计为 1%-5%(Basera etal 2015; Chen et al 2011; Kelleher et al 2016; Osborne et al 2011; Xepapadaki et al2016)。由于评估食物过敏的金标准要求进行食物激发实验，且只能在专业的研究中心开展，因此通过大规模人群的流行病学研究评估食物过敏是具有挑战性的。由于缺少大规模人群食物过敏的流行程度研究，同时相关的统计数据较少，可获取的数据表明全球范围内食物过敏患病率仍然很高(Jones and Burks 2017)。此外，尽管食物过敏定义和报告上的病例不一致使人群中食物过敏反应的流行程度难以评估，但美国食物过敏患病率在 0.5%至 2.5%之间(Turner and Campbell 2016)。
4图 1-2 世界范围内食物过敏反应的流行程度(Renz et al 2018)Figure 1-2. The prevalence of food allergy worldwide (Renz et al 2018)Rona 等人利用 51 篇出版文献的数据，对牛奶，鸡蛋，花生，鱼类和甲壳动物类的过敏反应流行情况进行荟萃分析(Rona et al 2007)。如表 1-1 所示这 5 种食物中的任何一种，儿童和成人的自我报告过敏反应的总体流行率分别为 12％和 13％。相比之下，通过双盲安慰剂对照食物激发试验评估时，成人和儿童的患病率为 3％。这些数据表明患者可能过度报告食物过敏反应的事实。同时，统计结果显示，牛奶的患病率最高，其中自我报告为 3％，皮肤点刺试验为 0.6％，食物激发试验为 0.9％。
华中农业大学 2018 届博士研究生学位论文态反应为速发型食物过敏，是最常见的过敏反应。在免疫反应过程中，食物作为抗原初次被人体中抗原呈递细胞识别时，可激活 Th2 细胞释放细胞因子 B 细胞产生抗原特异性 IgE(Kay 2001)。人体中肥大细胞及血液中嗜碱粒细胞在大量受体可与 IgE 的 Fc RI 端结合，IgE 与靶细胞结合后，释放促炎介质，呈致敏状态(图 1-3)。当过敏原再次进入人体时，与细胞表面的两个相邻的 Ig结合形成“抗原桥”，通过 Fc RI 受体激活肥大细胞，使其进入脱粒状态，释化学介质，例如，组胺，N-乙酰己糖胺酶、蛋白酶、白细胞介素或促炎因子引发过敏症状，导致 I 型过敏反应(Janeway et al 2005)。这些化学介质能引起过敏反应症状，如过敏性鼻炎、哮喘、全身性过敏反应和急性荨麻疹综合征同时，嗜碱性粒细胞和活化嗜酸性粒细胞也能表达 Fc RI 受体，参与过敏症生(Valenta 2002)。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S666
【图文】：
图 1-1 食物的不良反应类型(Boyce Joshua Aet al 2010)Figure 1-1. Types of adverse reactions to food (Boyce Joshua Aet al 2010)2.2 食物过敏反应的流行病学调查研究进展食物过敏反应是影响人类健康的因素之一，尤其是发达国家的患病率呈现逐年增加的趋势。在全球范围内，澳大利亚的食物过敏患病率最高，有 10%的婴儿对一种或多种食物过敏，而欧洲和美国等其他发达地区的患病率估计为 1%-5%(Basera etal 2015; Chen et al 2011; Kelleher et al 2016; Osborne et al 2011; Xepapadaki et al2016)。由于评估食物过敏的金标准要求进行食物激发实验，且只能在专业的研究中心开展，因此通过大规模人群的流行病学研究评估食物过敏是具有挑战性的。由于缺少大规模人群食物过敏的流行程度研究，同时相关的统计数据较少，可获取的数据表明全球范围内食物过敏患病率仍然很高(Jones and Burks 2017)。此外，尽管食物过敏定义和报告上的病例不一致使人群中食物过敏反应的流行程度难以评估，但美国食物过敏患病率在 0.5%至 2.5%之间(Turner and Campbell 2016)。
4图 1-2 世界范围内食物过敏反应的流行程度(Renz et al 2018)Figure 1-2. The prevalence of food allergy worldwide (Renz et al 2018)Rona 等人利用 51 篇出版文献的数据，对牛奶，鸡蛋，花生，鱼类和甲壳动物类的过敏反应流行情况进行荟萃分析(Rona et al 2007)。如表 1-1 所示这 5 种食物中的任何一种，儿童和成人的自我报告过敏反应的总体流行率分别为 12％和 13％。相比之下，通过双盲安慰剂对照食物激发试验评估时，成人和儿童的患病率为 3％。这些数据表明患者可能过度报告食物过敏反应的事实。同时，统计结果显示，牛奶的患病率最高，其中自我报告为 3％，皮肤点刺试验为 0.6％，食物激发试验为 0.9％。
华中农业大学 2018 届博士研究生学位论文态反应为速发型食物过敏，是最常见的过敏反应。在免疫反应过程中，食物作为抗原初次被人体中抗原呈递细胞识别时，可激活 Th2 细胞释放细胞因子 B 细胞产生抗原特异性 IgE(Kay 2001)。人体中肥大细胞及血液中嗜碱粒细胞在大量受体可与 IgE 的 Fc RI 端结合，IgE 与靶细胞结合后，释放促炎介质，呈致敏状态(图 1-3)。当过敏原再次进入人体时，与细胞表面的两个相邻的 Ig结合形成“抗原桥”，通过 Fc RI 受体激活肥大细胞，使其进入脱粒状态，释化学介质，例如，组胺，N-乙酰己糖胺酶、蛋白酶、白细胞介素或促炎因子引发过敏症状，导致 I 型过敏反应(Janeway et al 2005)。这些化学介质能引起过敏反应症状，如过敏性鼻炎、哮喘、全身性过敏反应和急性荨麻疹综合征同时，嗜碱性粒细胞和活化嗜酸性粒细胞也能表达 Fc RI 受体，参与过敏症生(Valenta 2002)。
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 邹奕;徐永莲;沈笑梅;程英;黄安源;喻s
本文编号：2758435
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