利用枯草芽孢杆菌表达系统进行大蒜抗菌基因筛选

发布时间：2020-07-17 21:05

【摘要】：抗菌肽在农业、食品、医疗等领域中具有较高的应用价值,因此被越来越多的研究人员所关注。筛选这些肽及其编码基因的传统技术较为繁琐,并且筛选到新编码基因的概率较低。本研究针对上述问题,利用枯草芽孢杆菌分泌表达系统,建立了一种全新高效的抗菌肽筛选策略。本研究利用枯草芽孢杆菌系统建立大蒜cDNA表达文库,与本实验室保存的大肠杆菌系统大蒜cDNA表达文库一起评估文库质量并进行后续筛选。以抗菌蛋白对宿主细胞的伤害作为指标,初步筛选在胞内具有抑菌活性的蛋白。枯草芽孢杆菌系统筛选到53个候选抗菌蛋白,大肠杆菌系统筛选到170个候选抗菌蛋白。通过扫描电子显微镜观察到,候选抗菌蛋白的菌体均表现出破损或缩皱的现象。提取上述候选抗菌蛋白的粗蛋白,在体外测试抑菌活性,结果表明,枯草芽孢杆菌系统大蒜cDNA文库筛选出11个具有广谱抑菌活性的肽,经测序均为未经过报道的基因。而大肠杆菌系统只筛选出1个具有抑菌活性的肽。因此,经过两个筛选系统的对比,证实了枯草芽孢杆菌系统筛选抗菌肽更加的高效、稳定。利用生物信息学预测抗菌肽的二级结构、等电点、分子质量等性质,根据二级结构将肽分成四类,结合抑菌数据,推测同时具有α-螺旋和β-折叠的这类肽具有较好的抑菌活性。为了探究抗菌肽的应用潜能,对抗菌肽进行溶血实验与热稳定性实验,结果证实,在肽浓度高达1000μg/mL时溶血活性基本低于5%,并且部分肽在100℃高温下仍具有一定的抑菌活性。在离体的烟草叶片上涂抹抗菌肽,能够不同程度的抑制辣椒疫霉侵染。将纯化后的抗菌肽AsR416处理细菌细胞,实验结果证实细菌的细胞膜受到了损伤,说明筛选到的抗菌肽能够破坏细胞膜的完整性。综上所述,本研究提供了一种新颖、灵敏且高通量分离抗菌基因的策略,并筛选到11个具有广谱抗性的新基因。根据本文的研究结果,植物和人类病原细菌、真菌甚至是癌细胞都有作为此筛选策略中靶标指示物的可能性,以达到针对性的筛选特异抗性基因的目的。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S633.4
【图文】：

信号肽,依赖性,枯草芽孢杆菌,目的地

利用枯草芽孢杆菌表达系统进行大蒜抗菌基因筛选及功能研究anne and Harwood 2010)。信号肽通常由较短的氨基酸组成，并在蛋白目的地后会立即被特异性信号肽酶和信号肽肽酶（SPP 酶）去除和降合成后通过不同的机制运输到目的地(Westers et al 2015)。为了适应不，枯草芽孢杆菌进化出了几种途径来满足这一要求：一般蛋白质分，双精氨酸途径（Tat）和 ATP 结合盒（ABC）转运蛋白（图 1-3）。

基因组序列,枯草芽孢杆菌,策略,代谢工程

还有其他提高分泌效率的方法（图1-4）。例如，人为制造缺失蛋白酶的菌株，去除不必要的基因组序列(Kenji et al 2011,Manabe et al 2013)，或者优化代谢工程技术等等。通过基因组学和蛋白质组学的结合，利用合成生物学的方法可以改善工业中蛋白质的生产。

图谱,载体

pET-22b载体图谱

【相似文献】