猕猴桃表皮毛发育基因的筛选及其在海沃德猕猴桃中的基因编辑研究

发布时间：2020-07-18 16:56

【摘要】：猕猴桃果实维生素C含量高,具有均衡的矿物质营养、膳食纤维和利于人体健康的代谢物组分,被誉为“水果之王”。果皮毛是影响猕猴桃外观品质和消费的因素之一,果实少毛或无毛是猕猴桃育种的主要目标之一。本论文以‘红阳’猕猴桃(Actinidia chinensis cv.‘Hongyang’)、毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)、和山梨猕猴桃(Actinidia rufa)为材料,基于猕猴桃二代和三代转录组数据,筛选出2个调控猕猴桃表皮毛发育的候选基因并在六倍体美味猕猴桃‘海沃德’(Actinidia deliciosa‘Hayward’)中进行基因编辑研究,以筛选出调控猕猴桃表皮毛发育的基因,为基因编辑育种奠定基础。本试验主要结果如下:1.以AtGL1、AtGL2、AtGL3、AtTTG1和AtSAD2等5个调控拟南芥表皮毛起始和发育的基因为模板,基于猕猴桃基因组数据库,通过比对获得了相应的同源基因,通过蛋白质序列比对和进化树的构建和分析,分别获得了AtGL1的候选基因Achn116791,AtGL2的候选基因Achn198951,AtGL3的候选基因Achn244201、Achn302211和Achn071731,AtTTG1的候选基因Achn045741,AtSAD2的候选基因Achn379131和Achn379141。分析了上述候选基因在红阳猕猴桃、毛花猕猴桃和山梨猕猴桃的幼果、成熟叶和茎尖的表达水平以及在红阳猕猴桃果实不同发育阶段的表达水平。最后筛选出了2个调控猕猴桃表皮毛发育的候选基因:AtGL1的候选基因Achn116791和AtGL3的候选基因Achn302211,而基因AtSAD2的候选基因Achn379131可能不是调控猕猴桃表皮毛发育的关键基因。2.选取候选基因Achn116791,Achn302211和Achn379131为目标基因,利用软件CRISPRdirect,根据sgRNA设计的原则,对目标基因进行sgRNA设计,成功构建了目标基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导法转化海沃德猕猴桃叶盘。经抗性筛选和PCR鉴定,我们获得了16个猕猴桃Achn116791转基因株系,经测序分析有9个株系发生了碱基的插入、缺失或替换。通过叶片表皮毛的观察,4号、5号和6号株系的叶片表皮毛密度降低、长度变短;我们获得了4个猕猴桃Achn302211转基因株系,其中1个株系发生了碱基的插入,引起了叶片表皮毛密度降低、长度变短;我们获得了4个猕猴桃Achn379131转基因株系,但均未检测到靶位点被编辑。这些结果不仅说明Achn116791基因和Achn302211基因调控着猕猴桃叶片表皮毛的发育,也证实了在六倍体海沃德猕猴桃中可以利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑,且在本试验转基因株系中基因编辑效率为41.7%。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S663.4

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本文编号：2761167