结缕草ZjCSD1和ZjCCS基因的克隆与功能初步研究

发布时间：2020-07-18 21:57

【摘要】：铜锌超氧化物歧化酶(CSD)是植物响应逆境胁迫过程中的关键酶,其含量和活性与植物抗逆性密切相关。CSD基因已在多种植物中完成了克隆与功能鉴定,而关于结缕草CSD基因的报道很少。本研究以结缕草cDNA为模板,利用同源克隆法,从结缕草转录组数据库中获得了结缕草ZjCSD1基因,该基因编码一个含有152个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析表明:ZjCSD1基因编码蛋白为稳定的、亲水的、酸性、非分泌脂溶蛋白,含有CSD蛋白家族特有的保守结构域,具有典型的Cu2+和Zn2+结合位点;与小米、玉米等禾本科植物具有较高的同源性,亲缘关系较近。亚细胞定位表明ZjCSD1蛋白定位于细胞质中。采用实时荧光定量PCR研究该基因在不同组织中、不同胁迫处理下的表达模式,结果表明:ZjCSD1基因在结缕草的根、茎和叶中都有表达,且叶中的表达量最高;干旱胁迫(30%PEG)、盐胁迫(150 mM NaCl)和Cd2+胁迫(200 mg/l Cd2+)均能诱导ZjCSD1基因表达量上调,Pb2+胁迫(1 g/1 Pb2+)诱导ZyjCSSD1基因表达量下调。因此结缕草ZjCSD1基因响应干旱、盐和重金属胁迫。通过农杆菌介导法,在禾本科模式植物水稻中过表达ZjCSD1基因,成功获得并鉴定了 102个转基因水稻株系。转基因子代的表型有待后续试验探究。CSD的激活主要依赖于其铜分子伴侣蛋白,铜锌超氧化物歧化酶铜分子伴侣蛋白(CCS)是一种胞内铜转运蛋白,其功能是通过蛋白间相互作用,将铜离子运输给CSD,进而激活CSD。在本实验室前人研究的基础上,本文通过RACE扩增得到了ZjCCS基因ORF前的75个碱基序列以及3种不同长度的3'-UTR序列,同时发现ZjCCS基因可以从两个不同的转录起始位点开始转录。亚细胞定位分析表明ZjCCS全长蛋白定位于叶绿体,而去掉转运肽的ZjCCS蛋白定位于细胞质。采用实时荧光定量PCR研究ZjCCS基因在结缕草不同组织中的表达模式,发现ZjCCS基因在根、茎和叶中都有表达,且叶中的表达量最高,根中的最低。通过农杆菌介导法,在水稻中过表达ZjCCS基因,成功获得并鉴定了 30个转基因水稻株系。转基因子代的表型有待后续试验探究。此外,通过酵母双杂和BiFC证明了去掉叶绿体转运肽的结缕草ZjCCS蛋白能够与ZjCSD1蛋白在细胞质中互作,且ZjCCS第160～286个氨基酸区段在互作的过程中至关重要。综上所述,本文对结缕草ZjCSD1和ZjCCS基因进行了克隆与功能初步研究,有利于进一步了解CSD和CCS基因在结缕草应对逆境胁迫过程中的作用,并为后期研究结缕草中CCS激活CSD的分子机制提供理论依据。
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S688.4
【图文】：

完成了基因组测序，因此被广泛用于遗传和分子研究。植物是复杂的多细胞生物，在逡逑运输铜等必需微量营养素的过程中要通过较长的距离，且在到达靶位点之前需要跨越逡逑多个膜系统。如图１－２所示，ＣＯＰＴ１是一种类Ｃｔｒ转运蛋白，铜离子在ＣＯＰＴ１的作逡逑用下从质外体跨过细胞膜，进入细胞内，再由铜伴侣蛋白螯合或运输至靶标。ＣＯＰＴ１逡逑７逡逑

２．３．２结缕草Ｚｙ‘ＣＳＺ）７基因编码蛋白的理化性质与结构特征分析逡逑利用在线工具Ｐｒｏｔｐａｒａｍ预测ＺｙＣＳＴ）／基因编码蛋白的基本理化性质，结果表明逡逑该蛋白相对分子量为１５．０８３６ｋＤ，分子式为Ｃ６４４Ｈｕ）２９Ｎ１９７０２１６Ｓ３，理论等电点５．７６。由逡逑１８种氨基酸组成，其中Ｇｌｙ占１９．７％，比例最高。蛋白质不稳定指数为］４．５０邋（＞４０逡逑时不稳定），脂溶指数为７７．６３，总平均疏水指数为－０．２５７。因此推测该蛋白是稳定的、逡逑酸性、亲水脂溶蛋白。利用ＴＭＨＭＭ２．０在线工具预测ＺｊＣＳＤ］蛋白的跨膜结构域，逡逑结果表明ＺｊＣＳＤｌ蛋白无跨膜螺旋，整条肽链都位于膜外；利用在线工具ＳｉｇｎａｌＰ邋４．１逡逑对ＺｊＣＳＤｌ蛋白的信号肽进行预测，结果显示ＺｊＣＳＤｌ蛋白Ｎ端不含信号肽，为非分逡逑泌蛋白；利用ＴａｒｇｅｔＰ邋１．１对ＺｊＣＳＤｌ蛋白进行亚细胞定位预测，结果表明ＺｊＣＳＤｌ蛋逡逑白位于细胞质中。综上推测ＺｊＣＳＤｌ蛋白是位于细胞质中的非分泌蛋白。逡逑２．３．３结缕草Ｚｙ＿Ｃ５Ｄ７基因编码氨基酸序列同源性与系统进化分析逡逑在ＮＣＢＩ中，利用Ｂｌａｓｔ检索并下载与结缕草ＺｙＣＳＤＹ基因编码的氨基酸序列相逡逑似性较高的序列，在ＤＮＡＭＡＮ中进行比对。结果表明，ＺＪＣＳＤ／基因编码的氨基酸逡逑序列与玉米中的相似性达９１％，与二穗短柄草、獐茅、欧洲大叶杨等相似性达逡逑８５°／。？８９％。另外，ＣＳＤ蛋白的不同氨基酸区段序列保守程度不同，Ｃ端序列较Ｎ端逡逑

图２－５邋ＺｊＣＳＤｌ蛋白与其他物种ＣＳＤ蛋白氨基酸序列的系统进化树分析；节点处的数字表示逡逑ｂｏｏｔｓｔｒａｐ验证重复１０００次该节点可信度的百分比逡逑Ｆｉｇ．２－５邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ＺｊＣＳＤｌ邋ａｎｄ邋ＣＳＤ邋ｆｒｏｍ邋ｏｔｈｅｒ邋ｓｐｅｃｉｅｓ．邋Ｔｈｅ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｂｒｕｎｃｈ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ逡逑ｔｈｅ邋ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ邋ｐｅｒｃｅｎｔ邋ｏｆ邋ｂｏｏｔｓｔｒａｐ邋ｖａｌｕｅ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋１０００邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．逡逑２２逡逑

【参考文献】

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本文编号：2761481