莲腐败病菌三个PG基因真核表达及功能分析

发布时间：2020-07-21 12:07

【摘要】：尖孢镰刀菌莲专化型(Fusarium oxysporum f.sp.nelumbicola)引起的莲腐败病是对莲产业威胁最大的一种毁灭性病害。莲腐败病菌从受伤的根茎侵入,通过莲维管束向上部和叶部蔓延,堵塞木质部导管。多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)是植物病原菌最重要的致病因子之一,在病原菌侵染寄主引起病害过程中起着关键作用。课题组前期证实莲腐败病菌侵染致病过程中能够产生多种细胞壁降解酶,其中PG活性最高。从莲腐败病菌中克隆获得了6个PG基因,其中3个基因pg1、pg5和pgb在病原菌侵染48 h后诱导表达量最高。本论文通过真核表达、亚细胞定位、基因敲除等技术进一步从分子和细胞水平分析这3个PG基因在病原菌致病过程中的作用。1.通过毕赤酵母表达系统成功构建了3个PG同工酶的真核表达载体,利用甲醇诱导分泌出胞外蛋白PG1、PG5和PGb,分子量大小分别为38 KDa、37 KDa和53 KDa,与之前预测的分子量大小一致。重组蛋白pPICZαA-pg1在30-60℃之间活性较高,最适温度为40℃,活性3.268 U/mg,在pH9.0时活性最高;重组蛋白pPICZαA-pg5在50℃时活性最高,为3.028 U/mg,最适pH6.0;重组蛋白pPICZαA-pgb最适温度为50℃,最适pH10.0。2.用真核体外表达重组蛋白pPICZαA-pg1、pPICZαA-pg5和pPICZαA-pgb分别对白莲莲鞭进行注射接种。接种1 d后,分别接种3个重组蛋白pPICZαA-pg1、pPICZαA-pg5和pPICZαA-pgb的白莲处理均显著发病,表现为叶片从叶缘处缓慢向叶中间萎蔫,为典型的莲腐败病菌致病症状。接种重组蛋白pPICZαA-pg1和pPICZαA-pgb的莲植株在接种4 d后基本整株枯萎死亡。接种pPICZαA-pg5的莲植株则在7 d后基本整株枯萎死亡。石蜡切片观察发病和健康植株叶片和莲鞭细胞壁,发现发病叶片细胞的细胞壁发生严重的降解,组织间隙离析,细胞呈松散状。3.采用Gateway克隆等技术构建了定位表达载体pCNH1-eGFP-pg1、pCNH1-eGFP-pg5和pCNH1-eGFP-pgb,通过注射浸润法将农杆菌导入本氏烟瞬时表达,利用激光共聚焦显微镜观察在植物细胞中的亚细胞定位。3个融合蛋白都主要定位于植物细胞的细胞质,此外,还发现在细胞核内pCNH1-eGFP-pgb融合蛋白也有明显的荧光信号,说明PGb还能作用于寄主细胞的细胞核内。4.通过同源重组的方法构建了pg1、pg5和pgb的基因敲除载体,并利用ATMT的方法进行转化F23a,成功获得了△pg1、△pg5、△pgb单基因缺失突变体。将各突变体接种莲进行致病性测定。一个月后,对照组植株全部发病枯萎死亡,突变体F23a△pg1发病显著比野生型轻,表现为叶片从叶缘处向叶中间蜷曲萎蔫,未整株枯死;突变体F23a△pg5发病较突变体F23a△pg1重;突变体F23a△pgb发病最重,与野生型没有显著差异。说明pg1敲除后,莲腐败病菌致病力显著下降,pg1在莲腐败病菌侵染过程中起着主要作用,而pg5和pgb基因敲除后,其侵染致病能力没有显著下降,说明该基因功能可能被其他基因功能互补。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.45
【图文】：

电泳图,电泳图,重组质粒,条带

败病菌 PG1、PG5 和 PGB 同工酶 cDNA 的全长 Xho I 和 Not I 酶切位点的特异性引物。通过 P I 酶切位点的各目的基因片段。PCR 产物通过 1%分别克隆到 PMD18-T 载体上，获得重组质D18-T-pgb，送公司测序。测序结果显示，pg1列为 1074 bp，pgb 编码区序列为 1434 bp，与原和 Not I 酶分别对重组质粒 PMD18-T-pg1梭载体 pPICZαA 进行双酶切。结果可见，重组条 3000 bp 和一条 1000 bp 左右的条带，其中，而 1000 bp 左右的条带是 pg1 编码区序列（切后，也切出一条3000 bp 和1000 bp 左右的条码区序列（1074 bp）。PMD18-T-pgb 双酶切后，切带，其中 1500 bp 左右的条带是 pgb 编码区序列片段约为 3600 bp（图 2.1）。

阳性克隆,菌液,条带

莲腐败病菌三个 PG 基因真核表达及功能分析转化到大肠杆菌 DH5α中扩繁，分别挑选 2-3 个单菌落进行 PCR 鉴定筛选阳性重。由图 2.2 可知，pPICZαA-pg1 的 1、2 号单菌落在预测的 1 500bp 位置有条带CZαA-pg5 的 1、2 号单菌落在预测的 1 500bp 位置有条带，pPICZαA-pgb 的 3 个落在预测的 2 000bp 位置均有条带。挑选较好的条带对应的菌液送公司测序。测果显示为目的基因的菌液确定为阳性重组子。菌液离心弃去上清，沉淀用 20%油保存置于-80℃冰箱中，用于后续实验。

电泳图,电泳图,重组质粒,真核表达

用于后续实验。ICZαA-pg1、pPICZαA-pg5 和 pPICZαA-pgb 阳engtification of cloning vector of pPICZαA-pg1pPICZαA-pgbM：DNAMarker；1-3：单菌落 PCR 产物 Marker, one to three were PCR products of sinb 三个基因的真核表达 pPICZαA-pg1，pPICZαA-pg5 和 pPICZ内切酶 SacI 单酶切进行线性化反应。由图小相一致，表明均酶切成功。

【参考文献】