蓝莓MIR414基因的克隆及其抗逆功能初探

发布时间：2020-07-23 00:44

【摘要】：蓝莓,学名越橘(Vaccinium spp.)是一种重要的经济型小浆果类果树,由于越橘果实中富含许多有益于人类健康的生物活性物质,因此关于越橘相关研究开始受到广泛关注。越橘根系浅、无根毛、吸收能力相对较差,干旱、盐等非生物胁迫成为其生产过程中主要的限制因子,因此挖掘越橘中抗性相关基因,利用分子手段进行品种改良,具有重要的理论与生产实践意义。mi RNAs是一类长度约为21nt具有调控功能的非编码RNA,目前研究表明mi RNAs在植物响应逆境过程中发挥着重要的作用。mi R414是植物中一个比较保守的mi RNA,生物信息学预测表明它可能与植物响应逆境相关,然而目前尚未见到植物mi R414生物学功能方面的报道。实验室前期利用基于EST生物信息学预测的方法预测了一个MIR414基因,本研究以半高丛越橘品种北陆“Northland”为实验材料,克隆越橘中MIR414基因,并在模式植物拟南芥中研究其响应逆境方面的功能,具体结果如下:1.提取越橘基因组DNA,根据EST序列设计带有Bam HI和Sac I酶切位点的引物,克隆了MIR414基因,分子大小为361bp,与预期大小一致。2.将目的基因片段构建到表达载体p BI121上,获得了p BI121-MIR414载体,利用农杆菌侵染转化法将p BI121-MIR414载体转入到模式植物拟南芥中。3.利用抗生素与PCR检测相结合的方法筛选出转基因阳性植株,将阳性苗移栽继续培养,收获T1代种子,随后不断筛选直至获得T3代纯和体种子,用于随后研究。4.将T3代纯合体拟南芥和野生型种子分别种到含有0 mmol/L、50 mmol/L、100mmol/L、150 mmol/L氯化钠的MS培养基中,然后对转基因和野生型拟南芥的种子萌发率和绿苗率进行统计。统计分析发现转基因拟南芥在盐胁迫下种子萌发率高于野生型,并且随着盐浓度的增加二者之间的种子萌发率差距越明显,当氯化钠浓度达到150 mmol/L时,2个转基因拟南芥株系的萌发率分别达到81.63%、90.67%,而野生型的萌发率仅为57.74%;随后对绿苗率进行了统计发现在盐胁迫条件下转基因拟南芥绿苗率低于野生型拟南芥,随着盐浓度的增加二者之间差距越明显,当氯化钠浓度为150 mmol/L时,野生型拟南芥的绿苗率达到47.05%,而2个转基因拟南芥株系的绿苗率分别为13.77%、20.13%。5.将T3代纯合体拟南芥和野生型种子分别种到含有0 mmol/L、100 mmol/L、200mmol/L、300 mmol/L甘露醇的MS培养基中。统计分析发现在300 mmol/L甘露醇模拟干旱胁迫条件下转基因拟南芥的种子萌发率明显高于野生型,2个转基因株系的种子萌发率分别为95.64%、97.16%,而野生型的种子萌发率为83.64%;而当甘露醇浓度为300 mmol/L时转基因拟南芥的绿苗率明显低于野生型,2个转基因株系的绿苗率分别为57.38、48.56%,野生型的绿苗率达到72.09%。综合上述结果,越橘MIR414基因在盐和甘露醇模拟的干旱胁迫条件下促进了种子的萌发,而对绿苗率却有一定的抑制作用,这为随后深入研究越橘MIR414在响应非生物胁迫方面的功能奠定了基础,也为在其它物种中展开MIR414的功能研究提供了参考。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S663.9

【参考文献】