利用sRNA序列检测分析小黄姜（Zingiber officainale Rosc.）病毒

发布时间：2020-07-23 17:43

【摘要】：姜(Zingiber officainale Rosc.)属多年生单子叶草本植物,它在植物分类学上属于姜科(Zingiberaceae),姜属(Zingiber Mill.),是我国重要的经济作物。姜不开花或很少开花,栽培上长期采用无性繁殖,致使种姜体内含有多种病菌和病毒,而病毒的感染造成姜的产量和品质严重下降。检测分析小黄姜未知病毒,对小黄姜的病毒防治有一定理论意义。鉴于此,本研究利用sRNA高通量深度测序技术检测分析了贵州省六盘水六枝特区折溪小黄姜病毒。并对该病毒的分子生物学特性进行了初步探究。所获研究结果如下:1.本研究利用sRNA高通量测序技术对贵州省六盘水市折溪乡的小黄姜进行了病毒预测,通过contigs拼接与病毒蛋白质数据库和核苷酸数据库比对,发现小黄姜中存在一个杆状DNA病毒(badnavirus)属的新成员,该病毒侵染我国小黄姜是国内的首次报道。2.贵州省六盘水市折溪乡的小黄姜存在杆状DNA病毒属的新病毒。1)使用Badnavirus的简并引物从小黄姜样品中扩增获得6条RT/RNase H基因序列,与已报到的Badnavirus相应序列的相似性均低于74%,根据目前的国际病毒分类委员会(the international committee on taxonomy of viruses,ICTV)病毒分类方案,Badnavirus病毒中RT和RNase H核苷酸基序相似度低于80%的可划为不同病毒种,从小黄姜中克隆出的病毒可能是Badnavirus中的一种新病毒,暂时命名为小黄姜杆状病毒(Zingiber bacilliform virus,ZBV)。与21个Badnavirus不同成员病毒构建系统进树,结果表明,扩增的6个分离物内存在3种Badnavirus新病毒。2)小黄姜杆状病毒的基因组为双链环状DNA,参考基因组长5564 bp,对序列进行生物信息学分析表明该序列存在多个Badnavirus成员的保守结构域。但没有普遍Badnavirus的ORF1与ORF2,该病毒基因组可能在进化中被删除一个片段。在自然界中,病毒是所有生物中具有最快的变异速度,通过片段的删除或插入等方式获得新的基因组顺序排列,以增加对寄主的适合度。研究结果表明小黄姜杆状病毒在进化过程中存在复杂的多态性。3.利用自己编写的Perl语言脚本分析了ZBV来源的sRNA在小黄姜杆状病毒参考基因组上的热点分布。结果显示,ZBV衍生的s RNA序列主要来源于正义链,以21 nt、22nt和24 nt大小为主,其中24 nt的sRNA数量最多,推测小黄姜在防御病毒侵染的过程中DCL3起到了主要作用。4.利用通用引物BadnaFP/BadnaRP对采自贵州省六盘水六枝特区折溪乡的30株小黄姜和20份5个地区的黄姜块茎进行杆状病毒PCR检测,发现所有样品中均扩增得到目的片段大小的产物,病毒检出率为100%。对实验室中的折溪小黄姜脱毒无菌苗进行ZBV病毒检测,结果呈样性,表明该病毒部分基因组或者全部基因组已经整合入小黄姜基因组中。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.32
【图文】：

杆状,病毒粒子,内含体,衣壳

图 1.3 Badnavirus 在世界范围内的分布（Bhat et al., 2016）Fig 1.3 Worldwide distribution of badnavirus3.2 杆状 DNA 病毒的形态学Badnavirus 的病毒粒子呈杆菌状，两端圆滑，侧边平行，无包膜，直径为 30nm，长度一般在 60 900 nm 之间，大多数为 130 nm，衣壳上无突起及其它外壳表面结构。该属大多数种的病毒粒子存在于寄主植物的细胞质中，单个或成群不规则分布，粒子分散或者排列成栅栏状，不在内含体或有膜囊泡结构中（洪健等， 2001）。3.3 杆状 DNA 病毒的分子生物学特性杆状 DNA 病毒的核酸为单分子开环状双链 DNA（Double stranded DNA,dsDNA），双链的每一条链上的特定位点都有一个带单链序列的缺口，基因组长

流程图,测序,流程图,条带

RNA 为核糖体 RNA（ribosome, rRNA），电泳后通过凝胶成像系统可观察到明显的 rRNA 条带。28s rRNA 和 18s rRNA 大小分别为 5 kb 和 2 kb 左右，且植物样品中最大 rRNA 亮度为次大 rRNA 亮度的 2 倍，否则表示 RNA 样品被降解。完整未降解的植物 rRNA 样品应看到 28s rRNA、18s rRNA 和 5sRNA 这三条带，顶端的条带亮度为第二条条带的 2 倍，若出现弥散片装和条带消失说明样品已降解。2.2 sRNA 深度测序sRNA 深度测序样品送至深圳华大基因研究院建库测序，使用 NEB 针对Illumina 测序平台研发的 Small RNA 建库试剂盒及配套试剂进行小 RNA 文库构建，库检合格的小 RNA 文库加载到测序芯片 flowcell 上，在 Illumina-HiSeq测序平台上进行 1 - 50bp 单端测序，流程图见图 1.4。

质量图,黄姜,长度分布,凝胶电泳

结果图 2.1），OD260/OD28 sRNA 测序要求。sR去除低质量序列后，ds，长度分布介于 18 920 条 18 30 nt 的小NA 序列做长度分布统25 nt（图 2.2）。长度分于后续实验分析及实验

【参考文献】