大白菜橙花和白花基因克隆及其形成的分子机理研究

发布时间：2020-07-26 18:13

【摘要】：在芸薹属作物中,花色是一个重要的性状,其变异来源广且种类繁多。花色具有遗传稳定和易于观察的特点,在通过去除杂株提高杂交种纯度和检测种间性状转移技术的可靠性等生产实践方面发挥重要的作用,同时还可以影响授粉者的行为。芸薹属作物花色的观赏价值很高,可作为旅游资源,对促进区域经济的发展上潜力巨大。因此开展大白菜橙花和白花基因的克隆及其形成的分子机理研究,将为大白菜花色育种和解析大白菜花色变异机理奠定基础。本研究以大白菜黄花自交系92S105、橙花自交系94C9和白花自交系15S1040及其杂交获得的F_1代、F_1植株回交或自交获得的BC_1F_1、BC_1F_2和F_2群体为研究材料,对橙花和白花基因进行精细定位,鉴定克隆了控制花色的候选基因,并分析了候选基因序列差异及其表达模式,同时对黄花、橙花和白花花瓣类胡萝卜素成分及类胡萝卜素相关基因表达进行了分析。本研究取得了如下主要的结果:1.遗传分析表明大白菜橙花性状由单隐性基因(Brof)控制。利用橙花自交系94C9和黄花自交系92S105为亲本构建的BC_1F_1和BC_1F_2定位群体,将橙花基因定位于A09染色体41.5 kb区间内,两侧标记为InDel409和dCAPS425,遗传距离为0.4 cM,区间包含6个注释基因。2.利用设计的定位区间内注释基因特异性引物克隆其cDNA序列,结果只成功克隆了Bra037124和Bra037125基因cDNA序列。Bra037124和Bra037125基因分别编码包含AP2结构域的转录因子和包含SEC-C元件和OTU结构域半胱氨酸蛋白酶家族蛋白。橙花自交系(94C9、15S1014和94B6)和黄花自交系(92S105和09Q5)中Bra037124和Bra037125基因的推导氨基酸序列分析表明,在Bra037124基因编码区内,黄花和橙花自交系间2个SNP突变导致氨基酸残基的改变;在Bra037125基因编码区内,黄花和橙花自交系间22个SNP突变和1个序列插入导致7个氨基酸残基的改变和1个氨基酸残基的插入。对92S105和94C9花瓣中定位区间内注释基因表达水平进行检测,结果显示Bra037124和Bra037125基因在92S105和94C9花瓣中表达水平较高且有显著差异,但其他基因表达水平较低甚至检测不到,这与克隆cDNA序列结果一致。Bra037124和Bra037125基因组织特异性表达分析显示,Bra037124基因在所有组织中均有表达,但在两亲本根中的表达差异倍数显著高于其他组织,且Bra037125基因在花瓣中的表达水平高于其他组织(根、茎和茎生叶)。根据上述结果和目前关于Bra037124同源基因功能的研究及Bra037125基因编码未知功能蛋白,综合分析认为Bra037125基因最可能为橙花性状候选基因。根据橙花和黄花自交系Bra037125基因DNA序列差异,开发了InDel601共分离标记。3.遗传分析表明大白菜白花性状由两对隐性基因控制,并将两个基因命名为Brwf1和Brwf2。利用白花自交系15S1040和黄花自交系92S105为亲本构建的F_2群体,将Brwf1基因定位于A01染色体49.6 kb区间内,两侧标记为S361和S363,遗传距离为0.11 cM,区间内有9个注释基因。将Brwf2基因定位于A09染色体59.3 kb区间内,两侧标记为S82和S83,遗传距离为0.08 cM,区间内包含12个注释基因。根据Brwf1和Brwf2定位区间内基因的注释信息,选择编码质体脂类相关蛋白(BrPAP)和类胡萝卜素异构酶(BrCRTISO)的基因Bra013602和Bra031539作为白花候选基因。4.通过比较白花自交系(15S1040、15S1001和17S690)和黄花自交系(92S105和09Q5)内Bra013602和Bra031539基因的推导氨基酸序列,发现在Bra013602基因编码区内,黄花和白花自交系间1个SNP突变导致氨基酸残基的改变,且该位点位于BrPAP保守结构域内;在Bra031539基因编码区内,黄花和白花自交系间1个SNP突变导致氨基酸残基的改变,且该位点位于BrCRTISO保守结构域内,同时3’末端大片段(943 bp)的插入导致了15个氨基酸残基的突变,1个氨基酸残基的插入和3个氨基酸残基的缺失。利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测了Bra013602和Bra031539基因在92S105和15S1040不同组织(根、茎、茎生叶和花瓣)中的表达水平,结果显示相比于其他组织,Bra013602和Bra031539基因在花瓣中均有较高的表达水平且Bra013602基因在92S105花瓣中的表达水平高于在15S1040中,但Bra031539基因的表达水平在两亲本间没有显著差异。通过透射电镜对黄花和白花花瓣内有色体的超微结构进行分析,结果显示黄花花瓣内有色体发育正常且质体小球(PG)数量较多,但白花花瓣内有色体发育不良且PG数量很少。这些结果证实了Bra013602和Bra031539为白花候选基因,同时分别获得了这两个基因的共分离标记W543和W61。5.通过高效液相色谱(HPLC)对大白菜黄花、橙花和白花花瓣中类胡萝卜素成分进行分析。结果显示黄花、橙花和白花花瓣中类胡萝卜素总含量分别为211.69±21.70μg/g、457.33±25.60μg/g和10.49±1.21μg/g,且黄花和白花花瓣主要积累紫黄质和叶黄素,但它们的类胡萝卜素总含量差异很大,可能导致了黄花和白花花色的差异;但橙花花瓣主要积累叶黄素和β-胡萝卜素,且橙花的形成可能主要由于β-胡萝卜素的积累。6.检测了类胡萝卜素代谢相关基因在黄花、橙花和白花花瓣中的表达水平。通过转录组分析表明,相比于黄花花瓣中,在橙花花瓣中β-胡萝卜素羟化酶基因(CHYB)和玉米黄质环氧化酶基因(ZEP)表达水平均降低,可能是导致β-胡萝卜素积累的原因。在黄花和白花花瓣中,qRT-PCR结果显示,大多数类胡萝卜素生物合成途径基因在白花花瓣中表达水平低于在黄花中,可能导致了白花花瓣中类胡萝卜含量的降低。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S634.1
【图文】：

胡萝卜素,代谢途径,双加氧酶,异构酶

3图 1-1 植物类胡萝卜素代谢途径（Tan et al. 2003；Chiou et al. 2010；Walter and Strack 2011）PSY，八氢番茄红素合成酶；PDS，八氢番茄红素脱氢酶；Z-ISO，ζ-胡萝卜素异构酶；ZDS，ζ-胡萝卜素脱氢酶；CRTISO，类胡萝卜素异构酶；LCYE，番茄红素 -环化酶；LCYB，番茄红素 β-环化酶；CHYB，β-胡萝卜素羟化酶；CYP97，细胞色素 P450 型单加氧酶 97；ZEP，玉米黄质环氧化酶；NXS，新黄质合成酶；VDE，紫黄质脱环氧化酶；CCD，类胡萝卜素裂解双加氧酶；NCED，9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶Fig. 1-1 Carotenoid metabolic pathway in plant（Tan et al. 2003; Chiou et al. 2010; Walter andStrack 2011）PSY, phytoene synthase; PDS, phytoene desaturase; Z-ISO, ζ-carotene isomerase; ZDS, ζ-Carotene desaturase;CRTISO, carotenoid isomerase; LCYE, lycopene -cyclase; LCYB, lycopene β-cyclase; CHYB, β-carotene hydroxylase;CYP97, cytochrome P450-type monooxygenase 97; ZEP, zeaxanthin epoxidase; NXS, neoxanthin synthase; VDE,violaxanthin de-epoxidase; CCD, carotenoid cleavage dioxygenases; NCED, nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenases

花色,大白菜,亲本,橙花

2群体。其他六个黄花和橙花自交系用于共分离标记的验证。图2-1 试验中所使用的两个大白菜亲本花色a，94C9；b，92S105Fig. 2-1 Flower colors of the two parental lines used in this studya, 94C9; b, 92S105两亲本和 BC1F1群体单株于 2015 年，两亲本、六个黄花和橙花自交系及 BC1F2群体单株于 2018 年种植于西北农林科技大学蔬菜试验基地，自然春化，管理条件相同。在盛花期，每个单株花色的确定需要经过两次观察，间隔 8 天且每株观察至少 10朵完全开发的花。2.1.2 DNA 和 RNA 提取，cDNA 合成和 PCR 扩增采用改良的 CTAB 法提取新鲜叶片基因组 DNA，参照 Porebski 等（1997）报道的方法

遗传连锁图谱,遗传连锁图谱,基因,群体

西北农林科技大学博士学位论文连锁图谱，同时将橙花基因限定于 A09 染色体 InDel181 和 InDel182 标记之间，遗传距离为 8.7 cM，对应的物理距离为 1.6 Mb（图 2-2a）。另外，利用 InDel181 和 InDel182检测黄花和橙花 DNA 混池，进一步验证了其与橙花基因连锁（图 2-3）。2.2.3 橙花基因的精细定位为了对橙花基因进行精细定位，利用双亲基因组在初定位区间内的 DNA 变异开发了 74 个 InDel 标记，其中 43 个在亲本间具有多态性（附录Ⅴ）。利用 InDel181 和InDel182 标记检测 BC1F1群体 478 个单株，共发现 50 个交换单株，其中 InDel181 侧24 个，InDel182 侧 26 个。

【参考文献】