硝酸银在‘凤丹’牡丹组培苗愈伤组织褐化过程中的生理生化作用研究

发布时间：2020-07-30 16:25

【摘要】：牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)在我国栽培历史悠久,属于名贵木本花卉,其不但具有很好的观赏价值与药用作用,在油用方面同样具有较高的开发利用价值。‘凤丹’牡丹(Paeonia ostii‘Feng Dan’)为牡丹野生种杨山牡丹的栽培品种,是中国油用牡丹主要栽培品种。已经有许多学者在‘凤丹’牡丹组织培养方面进行了尝试并且取得了一定的成果,但是在试验过程中均发现组培材料褐变是‘凤丹’牡丹快速繁殖体系建立的一大障碍,同时防褐剂在牡丹愈伤组织褐变过程中的作用机理还不够明确。因此探究硝酸银作为防褐剂在‘凤丹’牡丹组织培养进程中对褐变的抑制作用机理,能够为‘凤丹’牡丹褐化深层次原因分析以及新型防褐剂的开发提供理论支持。本试验中以‘凤丹’牡丹组织培养获得的增殖幼苗为材料,在含有0~5.0 mg·L~(-1)硝酸银的培养基中进行培养,并分三个时期进行取材,测量愈伤组织中的总酚含量、单体酚、总黄酮和相关酶活性变化,并选取了在多酚类物质合成途径中有着重要的生物学功能的转录因子和部分关键的酶类进行实时定量检测,从分子层面检验不同浓度的硝酸银抑制愈伤组织褐变的效果和影响。主要研究结果如下:(1)对比外植体的生长情况后发现,培养基中加入硝酸银能明显减轻愈伤组织的褐变情况,其中2.0 mg·L~(-1)的综合效果最好且对组培苗正常生长无影响。(2)通过高效液相色谱检测发现,硝酸银对组培苗褐变过程中产生影响的单体酚有绿原酸、芦丁、香豆酸、对香豆酸、表儿茶素、二氢槲皮素,其中芦丁含量最高且相较其他几种单体酚增幅也最大。(3)在硝酸银的影响下‘凤丹’牡丹愈伤组织中总酚含量、总黄酮含量与褐变等级呈现极显著相关性(P0.01),过氧化物酶(POD)活性与褐变程度呈现显著负相关(P0.05),多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量与褐变程度呈现显著正相关(P0.05),超氧化物歧物酶(SOD)活性与褐变等级之间不存在显著相关性。(4)通过对硝酸银处理过的愈伤组织进行荧光实时定量试验后发现,多酚类物质合成途径中的转录因子MYB2、WD40-1、WD40-2与结构基因苯丙氨酸解氨酶(PAL)、黄烷酮醇还原酶(DFR)、查耳酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、3-二氢黄酮羟化酶(F3H)、黄酮醇3’-羟化酶(F3’H)的表达量与褐变等级和总酚含量之间存在显著的相关性(p0.05)。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S685.11
【图文】：

类黄酮,合成代谢,途径,转录因子

图 1-2 类黄酮合成代谢途径（Li 2008）Figure 1-2 Pathway of flavonoids biosynthesis的结构基因外，还有部分基因通过合成转录因子来调节植物体内类黄酮的代谢（ Tonelli 2011）。参与类黄酮合成调节的转录因子主要有 3 类，包括 MYB，bHLH 和YB 类转录因子可以单独的调控某些类黄酮合成途径中的结构基因，或者与另外合体共同调控。此外，还有研究表明，MYB 还可以调节 bHLH 和 WD40 的表达自身的表达情况外，还可以调节另外两个转录因子的表达。由此可以看出，转表达是一个十分复杂的调控网络，并非某一个或几个基因能够决定的（Baudalez et al. 2008；Gonzalez et al. 2009；Jeong et al. 2010；Lea et al. 2007）。6

类黄酮,转录因子,代谢途径,抗氧化剂

图 1-3 类黄酮代谢途径中的转录因子（Petroni and Tonelli 2011）Figure 1-3 Transcription factors in flavonoid biosynthesis pathway1.4.3 褐变现象中酚类物质的研究现状褐变现象又被称为 “酚污染”（Balakrishnamurthy et al 1988）。组织培养过程中引起褐变的主原因为酶促褐变，酚类物质作为酶促褐变反应的底物，Dalal 等（1992）学者经研究发现其含量与变的发生具有正相关性，说明酚类是影响褐变水平的主要原因之一。酚类物质的含量与外植体褐紧密相关(Luo et al. 1999;郭倩 2014)。1.5 防褐剂的选用在培养基中加入抗氧化剂，或在含抗氧化剂的培养基中进行预培养，可大大减轻醌类物质的害。选用适宜的抗氧化剂与吸收剂种类及含量是防止外植体褐变的常用的方法。试验中，常用到的抗氧化剂是硝酸银、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、活性炭、植物凝胶、抗坏血( Vitamin C)、硫代硫酸钠（Na2S2O3）等。防褐剂的防褐效果因植物材料的不同而异。

凤丹,单体酚,硝酸银,牡丹

注：a:‘凤丹’组培苗在添加防褐剂的培养基上培养 10 d；b:培养 30 d；c: 培养 50 d图 3-3 不同浓度硝酸银对‘凤丹’牡丹愈伤组织单体酚含量的影响Figure 3-3 Effect of different concentrations silver nitrate on monomeric phenol content of Paeonia ostii‘Feng Dan’ callus3.3 不同浓度硝酸银对组培苗酶活性的影响3.3.1 多酚氧化酶（PPO）活性变化分析PPO 被认为是组培苗酶促褐变的主要原因之一，其底物在液泡中处于休眠状态，只有在细胞膜遭到损伤而引起亚细胞区域化改变时才会被激活，从而引起褐变。图表变化趋势显示：PPO 的活性随着培养时间的延长而增强，在不同的取材阶段 PPO 活性随着硝酸银浓度的增加先减弱后增强。当 AgNO3浓度为 2mg·L-1时 PPO 活性在各处理组中均最低（图3-4）。

【参考文献】