蓝色花葡萄风信子关键基因DFR和FLS调控花青苷积累的功能研究
发布时间：2020-07-31 14:38
【摘要】：葡萄风信子(Muscari spp.)是一种重要的观赏球根花卉。因其独特的蓝色色调和花型,被用于花园地被和家庭盆栽种植,也为研究蓝色花呈色机理提供了理想材料。葡萄风信子的花色形成主要依赖于类黄酮物质,特别是蓝色花青素衍生物。课题组前期研究推断葡萄风信子的二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)和黄酮醇合酶(FLS)基因可能通过调控花青素合成途径代谢通量共同调控蓝色花形成。本研究以蓝色葡萄风信子‘黑眼睛’(M.aucheri‘Dark Eyes’)为材料,对DFR和FLS基因调控葡萄风信子蓝色花形成机理进行研究,主要取得以下结果:(1)克隆得到两个DFR基因,分别命名为MaDFR(MK937098)和MaDFR1(KJ619964)。基因编码区全长均为1101 bp,编码366个氨基酸,蛋白质的分子量分别约为40.93 KDa和41.00 KDa;经氨基酸序列比对,两个蛋白同源性为97.27%。其中,MaDFR1和葡萄风信子‘白丽人’DFR序列同源性为100%。通过和其它物种已知功能的DFR蛋白序列比对发现,MaDFR和MaDFR1均具有保守的NADPH结合区域和底物特异性结合区域。聚类分析表明它们属于单子叶NADPH依赖性短链还原酶的二氢黄酮醇-4-还原酶家族。MaDFR和MaDFR1均定位于细胞质中,其转录表达具有组织特异性,尤其是在花中高表达,与飞燕草素的积累正相关。(2)体外原核表达及酶活分析表明,MaDFR和MaDFR1均具有催化二氢山奈酚(DHK)、二氢槲皮素(DHQ)和二氢杨梅素(DHM)生成相应无色花青苷的能力,并且,优先催化DHM生成无色的飞燕草素。此外,氨基酸点突变试验证实了底物结合特异区域中第135位的天门冬酰胺(N)和第146位的谷氨酸(E)决定着MaDFR和MaDFR1酶的底物催化活性。(3)通过农杆菌介导的叶盘法在模式植物烟草(Nicotiana tabacum‘NC89’)中过表达MaDFR(OE-MaDFR)和MaDFR1(OE-MaDFR1)。OE-MaDFR和OE-MaDFR1烟草花冠变成深红色。高效液相色谱(HPLC)方法定量分析,表明转基因植株中总花青苷的含量相对对照显著增加。此外,UPLC-Triple-TOF/MS质谱分析表明转基因植株中和对照株系中花青苷的种类相同,主要为矢车菊-3-芸香糖苷(Cy3R),无新物质生成。实时定量qPCR分析表明,OE-MaDFR1烟草花冠中,类黄酮3'5'羟化酶(F3'5'H)基因表达量较低,类黄酮生物合成途径的其它基因都上调表达,而OE-MaDFR烟草花冠中,上游结构基因查尔酮合成酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)基因下调表达,这可能是受植物体内类黄酮途径的反馈机制影响。烟草中F3'5'H基因在转基因株系和野生型株系中维持较低本底水平,这可能也是在转基因株系中未能检测到飞燕草素(Dp)的原因之一。(4)利用染色体步移法克隆得到DFR基因上游调控序列,大小为1518 bp,顺式作用元件分析结果表明,该启动子含有重要的CAAT-box、TATA-box,花色相关的光响应元件、以及MYB和MYC类型转录因子结合元件。构建DFR启动子全长及不同缺失融合的GUS报告基因载体,转化农杆菌GV3101菌株并稳定遗传转化烟草,进行GUS组织化学染色分析和GUS转录表达分析。结果表明,DFR基因启动子只在烟草花冠中表达,且缺失-231 bp--407 bp后,GUS酶活活性显著减弱。双荧光素酶试验分析表明,转录因子MaMYBA与MaDFR启动子的-231 bp--407 bp区域结合。(5)采用RACE克隆技术获得MaFLS基因cDNA序列(MH636605),全长为1418bp。MaFLS基因编码区为993 bp,编码330个氨基酸,蛋白质分子量约为36.45 kDa。氨基酸序列比对和聚类分析表明,MaFLS具有保守的亚铁结合位点(His 216,Asp 218和His 272)和2-氧代戊二酸结合位点(Arg 282和Ser 284),属于可溶性Fe2+/2-ODD蛋白家族。此外,MaFLS具有潜在催化DHQ活性的高度保守结合位点,即五个关键氨基酸位点(Tyr 127,Phe 129,Lys 197,Phe 288,Ser 290),它还具有FLS特异性基序“PxxxIRxxxEQP”和“SxxTxLVP”。MaFLS转录表达具有组织特异性,在花发育的S1(刚形成花蕾期)和S2(花蕾刚开始着色)阶段表达,但是其表达与葡萄风信子中总黄酮醇的积累无关。(6)与野生型烟草粉色花相比,OE-MaFLS烟草株系花冠表现出不同程度的颜色变化:淡粉色至几乎白色、浅粉色和粉色。对比野生型株系,MaFLS转基因烟草花冠中花青苷的含量显著降低,而总黄酮醇的积累显著增加。qPCR分析表明,转基因烟草株系中的NtCHS,黄烷酮3羟化酶(NtF3H),NtDFR,花青素合成酶(NtANS)和烟草R2R3MYB转录因子(NtAN2)表达显著降低,NtFLS基因明显上调表达。综上所述,MaDFR通过优先催化二氢杨梅素导致代谢通量流向蓝色飞燕草素的生成;MaFLS通过与MaDFR竞争共同底物二氢黄酮醇生成黄酮醇类辅色物质。二者共同调控葡萄风信子的蓝色花发育。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S682.29
【图文】：
图 1-1 苯丙烷途径的类黄酮生物合成分支的示意图(Nielsen et al. 2002)Figure 1-1. Diagrammatic representation of part of the flavonoid biosynthetic branch of thephenylpropanoid pathway (Nielsen et al. 2002).1.3 花青苷和黄酮醇与花色的关系在类黄酮化合物中，花青苷是花青素前体的糖基化形式，是类黄酮化合物的一种，该亚组包括至少 400 个分子，颜色从橙红色到紫色不等，取决于 pH 值，共色素沉着，可用的金属阳离子和骨架的修饰 (Hichri et al. 2011)。最主要的花青素有六大类：飞燕草素、天竺葵素、矢车菊素、芍药色素、锦葵素和矮牵牛素 (Tanaka and Ohmiya 2008)。从而导致自然界中发现的黄酮类化合物的多样性和丰富的颜色如紫色，蓝色，橙色和红色色素沉着。此外，各种花色图案，例如斑点，杂色，条纹，花边和渐变，是由不同的花青素积累模式引起的。花青苷基本结构单元 B 环上的羟基数有助于植物颜色，羟基越多，颜色越蓝。蓝色/紫色花朵通常包含基于飞燕草素的花青苷，洋红色/红色花朵主要包含基于矢车菊素的花色苷，橙/砖红色花中含有基于天竺葵素的花色苷
图 1-2 二氢黄酮醇 4-还原酶催化底物的化学反应示意图Figure 1-2. A schematic diagram showing the chemical reaction catalyzed by dihydroflavono4-reductase..5.3 黄酮醇合酶 (FLS) 基因与花色形成花色是观赏植物的价值体现，花青素有助于植物呈现丰富多彩的颜色，辅色素和其它类黄酮一起影响花色的色调和深浅，并且可以稳定色素沉着并使花色蓝avies et al. 2003; Nielsen et al. 2002)。黄酮醇是一组黄酮类化合物，可以作为花青辅色素导致花色迁移和花色变化 (Nielsen et al. 2002)。而且，黄酮醇本身可赋予黄者黄色着色 (Zhou et al. 2013)。花青素和黄酮醇均由类黄酮途径的分支产生，并衍生自二氢黄酮醇 (二氢山萘HK，二氢槲皮素：DHQ 和二氢杨梅素：DHM)。花青素是通过二氢黄酮醇 4-还原FR)，花青素合成酶 (ANS) 和葡萄糖基转移酶 (UFGT) 的连续反应合成的。在与分支点的 DFR 竞争时，单独作用的 FLS 可以催化二氢黄酮醇生成黄酮醇。FLS 的在于可溶性 2-ODD，其需要辅助因子 2-氧代戊二酸，亚铁（II）和抗坏血酸，并
27阅读框 (1101bp)。设计 ORF 全长引物，以葡萄风信子花发育的 5 个不同时期的 cDNA混合物为模板克隆得到两条cDNA序列全长 (图2-1)，ORF编码366个氨基酸（图2-2，2-3)，命名为 MaDFR 和 MaDFR1，MaDFR1 和课题组前期在葡萄风信子‘白丽人’中克隆出来的氨基酸序列同源性为 100%，登录号为 KJ619964；预测的蛋白分质子量分别为40.93 KDa和41.00 KDa，将得到的MaDFR序列提交到GenBank，登录号为MK937098。图 2-1 葡萄风信子 MaDFR 和 MaDFR1 基因编码区的 cDNA 克隆M：Trans 2K plus DNA marker；泳道 1：MaDFR 基因全长扩增；泳道 2：MaDFR1 基因全长扩增。Figure 2-1 The cDNA clone of the coding region of MaDFR and MaDFR1 genes from grape hyacinthM
本文编号：2776604
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S682.29
【图文】：
图 1-1 苯丙烷途径的类黄酮生物合成分支的示意图(Nielsen et al. 2002)Figure 1-1. Diagrammatic representation of part of the flavonoid biosynthetic branch of thephenylpropanoid pathway (Nielsen et al. 2002).1.3 花青苷和黄酮醇与花色的关系在类黄酮化合物中，花青苷是花青素前体的糖基化形式，是类黄酮化合物的一种，该亚组包括至少 400 个分子，颜色从橙红色到紫色不等，取决于 pH 值，共色素沉着，可用的金属阳离子和骨架的修饰 (Hichri et al. 2011)。最主要的花青素有六大类：飞燕草素、天竺葵素、矢车菊素、芍药色素、锦葵素和矮牵牛素 (Tanaka and Ohmiya 2008)。从而导致自然界中发现的黄酮类化合物的多样性和丰富的颜色如紫色，蓝色，橙色和红色色素沉着。此外，各种花色图案，例如斑点，杂色，条纹，花边和渐变，是由不同的花青素积累模式引起的。花青苷基本结构单元 B 环上的羟基数有助于植物颜色，羟基越多，颜色越蓝。蓝色/紫色花朵通常包含基于飞燕草素的花青苷，洋红色/红色花朵主要包含基于矢车菊素的花色苷，橙/砖红色花中含有基于天竺葵素的花色苷
图 1-2 二氢黄酮醇 4-还原酶催化底物的化学反应示意图Figure 1-2. A schematic diagram showing the chemical reaction catalyzed by dihydroflavono4-reductase..5.3 黄酮醇合酶 (FLS) 基因与花色形成花色是观赏植物的价值体现，花青素有助于植物呈现丰富多彩的颜色，辅色素和其它类黄酮一起影响花色的色调和深浅，并且可以稳定色素沉着并使花色蓝avies et al. 2003; Nielsen et al. 2002)。黄酮醇是一组黄酮类化合物，可以作为花青辅色素导致花色迁移和花色变化 (Nielsen et al. 2002)。而且，黄酮醇本身可赋予黄者黄色着色 (Zhou et al. 2013)。花青素和黄酮醇均由类黄酮途径的分支产生，并衍生自二氢黄酮醇 (二氢山萘HK，二氢槲皮素：DHQ 和二氢杨梅素：DHM)。花青素是通过二氢黄酮醇 4-还原FR)，花青素合成酶 (ANS) 和葡萄糖基转移酶 (UFGT) 的连续反应合成的。在与分支点的 DFR 竞争时，单独作用的 FLS 可以催化二氢黄酮醇生成黄酮醇。FLS 的在于可溶性 2-ODD，其需要辅助因子 2-氧代戊二酸，亚铁（II）和抗坏血酸，并
27阅读框 (1101bp)。设计 ORF 全长引物，以葡萄风信子花发育的 5 个不同时期的 cDNA混合物为模板克隆得到两条cDNA序列全长 (图2-1)，ORF编码366个氨基酸（图2-2，2-3)，命名为 MaDFR 和 MaDFR1，MaDFR1 和课题组前期在葡萄风信子‘白丽人’中克隆出来的氨基酸序列同源性为 100%，登录号为 KJ619964；预测的蛋白分质子量分别为40.93 KDa和41.00 KDa，将得到的MaDFR序列提交到GenBank，登录号为MK937098。图 2-1 葡萄风信子 MaDFR 和 MaDFR1 基因编码区的 cDNA 克隆M：Trans 2K plus DNA marker；泳道 1：MaDFR 基因全长扩增；泳道 2：MaDFR1 基因全长扩增。Figure 2-1 The cDNA clone of the coding region of MaDFR and MaDFR1 genes from grape hyacinthM
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 安维忠;刘雅莉;刘红利;陈凯利;;葡萄风信子MaANS基因及启动子的克隆与分析[J];西北植物学报;2015年09期
2 焦淑珍;刘雅莉;娄倩;姜玲;;葡萄风信子二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)的克隆与表达分析[J];农业生物技术学报;2014年05期
3 陈建;陈晨甜;吕长平;;观赏植物花色形成影响因子研究进展[J];现代园艺;2009年06期
相关博士学位论文 前3条
1 陈凯利;葡萄风信子MYB和bHLH转录因子对花青苷合成的调控研究[D];西北农林科技大学;2017年
2 娄倩;葡萄风信子（Muscari）花色形成与相关基因研究[D];西北农林科技大学;2014年
3 徐伟荣;中国华东葡萄抗白粉病芪合成酶基因及启动子克隆与功能分析[D];西北农林科技大学;2010年
本文编号：2776604
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/yylw/2776604.html
