CsEXP10基因RNAi干扰载体导入黄瓜的研究
发布时间：2020-08-08 17:15
【摘要】：扩张蛋白是一类植物细胞壁活性蛋白,普遍存在于在正在生长的组织和成熟的果实中。黄瓜扩张蛋白基因CsEXP10基因来自于正在生长的黄瓜幼果,参与了黄瓜果实膨大生长过程。但该基因参与果实膨大生长进程、促进果实发育的作用机理目前还不明了。为了深入研究该基因的功能,本试验以“津优1号”黄瓜子叶节为外植体,研究了苗态、乙酰丁香酮(AS)在预培养和共培养基中的浓度、无菌水脱菌次数和噻孢霉素(Cef)在选择培养及生根培养基中的浓度对黄瓜遗传转化的影响,优化和建立了高效遗传转化体系;在此基础之上,通过农杆菌介导方法,将CsEXP10基因RNAi干扰载体成功导入黄瓜,获得了转基因植株,通过对转基因植株的生理生化指标测定,分析了干扰载体转化对黄瓜植株生长发育的影响;研究了NaCl胁迫对转基因黄瓜植株生长的影响,发现CsEXP10基因RNAi干扰载体的导入降低了黄瓜的耐盐性。主要研究结果如下:1.黄瓜遗传转化体系的优化。以“津优1号”黄瓜为试验材料,从苗态、AS和Cef浓度、无菌水冲洗次数、生根培养等几方面,优化和建立了农杆菌介导的黄瓜遗传转化体系。结果表明,取苗态为子叶抱合时的子叶节,放置在预培养基(MS+2.0 mg/L6-BA+2.0 mg/L AgNO3+100μmol/L AS)中培养2 d,接着在共培养基(MS+2.0 mg/L6-BA+2.0 mg/L AgNO3+100μmol/L AS)中培养2 d,用无菌水冲洗3次,然后置于筛选培养基(MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L AgNO3+300 mg/L Cef+100 mg/L Kan)上进行不定芽诱导培养,不定芽长至2~3 cm时,切取不定芽放于生根培养基(MS+0.2 mg/L IAA+400mg/L Cef)上生根培养4 d,后转到培养基(MS+400 mg/L Cef)上继续进行生根培养,可获得较高的转化率。2.CsEXP10基因RNAi干扰载体导入黄瓜。在建立和优化黄瓜遗传转化体系的基础之上,进行CsEXP10基因RNAi干扰载体的转化,共得到了119棵抗性植株,存活下来34棵,经过PCR检测,最终得到了4株阳性转基因苗,转化率为11.76%。3.CsEXP10基因的功能。以非转基因植株为对照,对转基因植株的部分生长指标进行测定。结果表明:转基因植株的净光合速率(Photo)、可溶性糖含量、过氧化物酶(POD)活性均明显低于非转基因植株,而丙二醛(MDA)含量明显高于非转基因植株;此外,转基因植株的生长势较弱,株高低于对照植株,幼果横径和纵茎小于对照植株,成熟果实瘦小畸形,而对照植株的果实长相周正,生长良好。这说明CsEXP10基因干扰载体的导入抑制了黄瓜植株的生长发育,该基因是黄瓜植株生长和果实发育相关基因。4.盐胁迫对转基因黄瓜植株的影响。以非转基因植物为对照,研究了150 mmol/L氯化钠(NaCl)溶液处理对转基因黄瓜植株生长的影响。结果表明,转基因植株的Photo、气孔导度(Cond)、胞间CO2浓度(Ci)及蒸腾速率(Trmmol)、叶绿素a、叶绿素b含量、可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性明显低于非转基因植株,MDA含量显著高于非转基因植株,而可溶性糖含量和POD活性与对照相比差异不显著。盐胁迫处理6 d后,所有黄瓜植株的叶片和茎部等部位逐渐变黄干枯,但转基因植株首先出现干枯死亡,这说明CsEXP10基因RNAi干扰载体的导入显著降低了黄瓜的耐盐性。
【学位授予单位】：河南科技学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S642.2
【图文】：
3）外植体的预培养外植体置于培养基表面，预培养（暗中）2 d。预培养基中添加不同浓为 0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L。3 24 个外植体。培养条件：温度 25℃。20 d 后统计不定芽数目，愈伤性芽数统计方法见公式（2-1）、（2-2）。4）菌株活化、菌液制备和农杆菌侵染图 2-1 苗态类型A：子叶抱合；B：子叶微展开角度呈 30°左右；C：子叶半展开子叶展开角度较大呈 60°左右； D：子叶展平；Fig.2-1 Type of steriled seeding states of cucumberA: Closed cotyledon; B:Opening angle of cotyledon between 0~30 degree ;C: Opening angle of cotyledon between 30~60 degree; D: Flattened cotyledonA B C D
.7 黄瓜子叶节遗传转化体系的建立本研究对外植体的苗态、预培养基、共培养基中 AS 的添加浓度、无菌水冲洗培养基中 Cef 的添加浓度以及生根培养基成分进行筛选优化，我们最终确定了组合方案，即在无菌苗子叶抱合（苗态类型 A）时切取外植体，置于预培养基（M/L 6-BA+2.0 mg/L AgNO3+100 μmol/L AS）中培养 2 d，接着在共培养基（MS+2.0A+2.0 mg/L AgNO3+100 μmol/L AS）中培养 2 d，用无菌水冲洗 3 次，然后置于基（MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/LAgNO3+300 mg/L Cef+100 mg/L Kan）上进行，不定芽长至 2~3 cm 时，切取不定芽放于生根培养基（MS+0.2 mg/L IAA+400图 2-2 不同培养基成分对生根的影响A：不良根系；B：生根前的白色愈伤；C：良好根系Fig.2-2 The influence of different culture medium on rootingA: Bad roots; B:Callus ; C: Good rootsA B C
2.2.8 黄瓜遗传转化过程中出现的问题农杆菌污染现象是以农杆菌为媒介的遗传转化过程中常见的问题，除此之外本研究发现，在黄瓜选择培养及驯化移栽过程中我们发现了许多问题（见图 2-4），在选择培养过程中常会出现外植体愈伤组织生根的现象，影响了不定芽的分化，可能是选择培养基的激素成分添加的比例失调造成的（图 A）；在再生苗转移无菌土中进行驯化移栽过程中，第一次移栽后的前几天是幼苗成活的关键时期，此阶段特别容易出现烂根的现象（图 B），造成移栽失败；驯化时植株容易发生雄花大量分化但雌花不分化的现象(图图 2-3 农杆菌介导的黄瓜子叶节遗传转化体系A：无菌苗种子；B：无菌苗；C：外植体的预培养；D：共培养；E：选择培养；F：生根培养；G—L：驯化及移栽Fig.2-3 Transfer by Agrobacterium mediation into Cotyledon nodes of cucumberA: Steriled seeds; B: Steriled seeding states; C: Pre-cultured of explants;D: Co-cultivation of explants;E: Select culture of explants; F: Rooting cultivation; G-L: Domestication and transplantingG H I J K L
【学位授予单位】：河南科技学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S642.2
【图文】：
3）外植体的预培养外植体置于培养基表面，预培养（暗中）2 d。预培养基中添加不同浓为 0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L。3 24 个外植体。培养条件：温度 25℃。20 d 后统计不定芽数目，愈伤性芽数统计方法见公式（2-1）、（2-2）。4）菌株活化、菌液制备和农杆菌侵染图 2-1 苗态类型A：子叶抱合；B：子叶微展开角度呈 30°左右；C：子叶半展开子叶展开角度较大呈 60°左右； D：子叶展平；Fig.2-1 Type of steriled seeding states of cucumberA: Closed cotyledon; B:Opening angle of cotyledon between 0~30 degree ;C: Opening angle of cotyledon between 30~60 degree; D: Flattened cotyledonA B C D
.7 黄瓜子叶节遗传转化体系的建立本研究对外植体的苗态、预培养基、共培养基中 AS 的添加浓度、无菌水冲洗培养基中 Cef 的添加浓度以及生根培养基成分进行筛选优化，我们最终确定了组合方案，即在无菌苗子叶抱合（苗态类型 A）时切取外植体，置于预培养基（M/L 6-BA+2.0 mg/L AgNO3+100 μmol/L AS）中培养 2 d，接着在共培养基（MS+2.0A+2.0 mg/L AgNO3+100 μmol/L AS）中培养 2 d，用无菌水冲洗 3 次，然后置于基（MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/LAgNO3+300 mg/L Cef+100 mg/L Kan）上进行，不定芽长至 2~3 cm 时，切取不定芽放于生根培养基（MS+0.2 mg/L IAA+400图 2-2 不同培养基成分对生根的影响A：不良根系；B：生根前的白色愈伤；C：良好根系Fig.2-2 The influence of different culture medium on rootingA: Bad roots; B:Callus ; C: Good rootsA B C
2.2.8 黄瓜遗传转化过程中出现的问题农杆菌污染现象是以农杆菌为媒介的遗传转化过程中常见的问题，除此之外本研究发现，在黄瓜选择培养及驯化移栽过程中我们发现了许多问题（见图 2-4），在选择培养过程中常会出现外植体愈伤组织生根的现象，影响了不定芽的分化，可能是选择培养基的激素成分添加的比例失调造成的（图 A）；在再生苗转移无菌土中进行驯化移栽过程中，第一次移栽后的前几天是幼苗成活的关键时期，此阶段特别容易出现烂根的现象（图 B），造成移栽失败；驯化时植株容易发生雄花大量分化但雌花不分化的现象(图图 2-3 农杆菌介导的黄瓜子叶节遗传转化体系A：无菌苗种子；B：无菌苗；C：外植体的预培养；D：共培养；E：选择培养；F：生根培养；G—L：驯化及移栽Fig.2-3 Transfer by Agrobacterium mediation into Cotyledon nodes of cucumberA: Steriled seeds; B: Steriled seeding states; C: Pre-cultured of explants;D: Co-cultivation of explants;E: Select culture of explants; F: Rooting cultivation; G-L: Domestication and transplantingG H I J K L
【参考文献】
相关期刊论文 前10条
1 吴家富;杨博文;向s愠
本文编号：2785860
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/yylw/2785860.html
