草莓ARF基因家族的生物信息学分析及MIR167与靶基因ARF6的功能鉴定

发布时间：2020-08-09 14:42

【摘要】：生长素参与调控植物生长发育的许多阶段,是十分重要的植物激素。同时,ARF家族对生长素信号进行调控,是一类重要的转录因子。迄今为止,拟南芥、葡萄、番木瓜、苹果等许多物种ARF家族生物信息学的研究相继被报道,但关于草莓ARF家族鲜有报道。本研究对草莓ARF基因家族进行生物信息学鉴定并构建了MIR167及ARF6过表达载体,ARF6干扰载体,获得了转基因草莓植株,通过转基因植株的表型观察揭示出草莓MIR167、ARF6基因的功能。主要结果如下:(1)从NCBI数据库中获得12个草莓ARF家族基因(FvARFs),分别是FvARF1、FvARF2、FvARF3、FvARF4、FvARF5、FvARF6、FvARF8、FvARF9、FvARF17、FvARF18、FvARF19和FvARF23。对家族基因进行系统进化分析,12个基因在进化树中被分为四个分支,FvARF6与AtARF6、FvARF3与MdARF3、FvARF23与MdARF23、FvARF1与MdARF1等为同一分支的姐妹基因对,进化关系较近。FvARFs不平均的分布在五条染色体上,FvARFs都含有三个保守的结构域,只有FvARF3、FvARF17、FvARF18是截断的CTD结构域。家族基因外显子、内含子结构不同,内含子的数量从1-16不等。利用MEME数据库分析显示,除FvARF17之外,家族基因保守基序分布及结构相似。(2)以‘艳丽’草莓为试材,采用qRT-PCR的方法对其不同器官、不同发育时期的果实进行基因表达量分析发现:FvARFs在所有器官中均有表达;在不同的果实发育阶段FvARFs的相对表达量均是随着果实的成熟表达量逐渐降低。(3)对‘Ruegen’草莓试管苗采用10μmol·L~(-1)的IAA分别处理0 h,6 h,12 h,24 h,48 h和不同IAA浓度(0μmol·L~(-1),0.1μmol·L~(-1),1μmol·L~(-1),10μmol·L~(-1),25μmol·L~(-1))处理12 h。qRT-PCR结果显示,10μmol·L~(-1)IAA处理12 h时ARF家族基因表达量最高。(4)利用RT-PCR的方法从‘艳丽’草莓中克隆出MIR167及靶基因ARF6,获得ARF6基因的编码区全长2646 bp,编码882个氨基酸,与NCBI数据库中二倍体ARF6序列相似度高达98.68%,克隆出的MIR167基因长度为305 bp。(5)构建了ARF6突变基因的过表达载体、MIR167基因过表达载体、ARF6干扰载体,采用农杆菌介导的遗传转化将其转入‘Ruegen’草莓苗中。得到MIR167过表达植株4个株系和ARF6干扰植株3个株系。表型观察发现MIR167过表达植株和ARF6干扰植株都表现出分枝数和根系数量的增加,ARF6干扰植株叶片深绿狭长并呈现出向内卷曲皱缩的现象。(6)构建了pGBKT7-ARF6融合载体并与pGBKT7空载体同时转化酵母菌感受态,通过一缺、三缺培养基的长势分析,鉴定出ARF6为转录激活因子。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S668.4
【图文】：

不均匀分布,草莓,染色体,条染

2.3 结果与分析2.3.1 草莓 ARF 基因家族的鉴定及染色体分布分析在草莓中共鉴定出 12 个 ARF 基因（表 2），这些基因的名称遵照 NCBI 数据库中现有的名称。12 个 FvARF 的分析结果，预测的蛋白长度在 510（FvARF17）到 1161（FvARF19）的范围内不等，ORF长度范围从1579 b（pFvARF17）到4703 b（pFvARF19）之间，CDS 序列的大小在 1530 bp（FvARF17）至 3933 bp（FvARF5）之间。此外，FvARF的理论等电点（PI）和分子量分别为5.25至8.29和10.065 kDa至130.113 kDa。结果与前人的结果一致（Die et al., 2018），表明这些 FvARF 在不同的亚细胞环境中起作用。为了进一步了解 FvARFs 在染色体上的分布，12 个 FvARFs 被定位在五条染色体上（图 1）。根据草莓 ARF 基因分布的特性，12 个 FvARFs 分布在 7 条染色体中的 5条，并且 FvARFs 呈现出了不均匀分布。其中，LG5 和 LG2 两条染色体上各含有三个 ARF 基因。LG1，LG4 和 LG3 的每个染色体含有两个 ARF 基因。

草莓,木瓜,系统发育关系,拟南芥

和 FvARF18 两个成员；第二组中，草莓家族只有个草莓家族基因，分别是最多，草莓中含有六个，即。同一染色体上的的不规则。该结果与鹰嘴豆研究的结果一致（们发现 9 个 FvARFs前人的研究我们将处于进化树的同一分支中的两个基因命名为姐妹基al., 2015），包括，FvARF1 和 MdARF1F8，FvARF6 和 AtARF6姐妹基因对数量最多，这与苹果和草莓同属蔷薇科的原因密切相关。在们将其中一个小分支命名为他物种都没有发现与之高度相似的基因，意味着这些能长期演变获得的（FvARF3FvARF2，FvARF4 和 FvARF23；第四组含有最多，草莓中含有六个，即 FvARF1，FvARF5，FvARF6，FvARF8FvARF 蛋白属于不同的亚群，说明了Die et al., 2018与进化树中的其他物种的 ARF 家族成员有相对密FvARF17 和 CpARF17，FvARF3 和 MdARF3，FvARF4 和 AtARF4，FvARF5 和 MdARF5。然而，我们发现草莓之间中没有姐妹基因对IIa，这里 9 个拟南芥 ARF 基因属于一个独AtARFLuo et al., 2014; Ha et al., 2013）（图 2一个成员；；第四组含有，FvA白属于不同的亚群，说明了 FvARFs 的分）。在所有，FvAR，F是通过拟）。

蛋白质结构域,基因结构,结构域

第二章草莓生长素响应因子家族全基因组鉴定及表达分析.3.3 ARF 基因家族结构分析典型的 ARF 具有三个保守结构域，分别是位于 N 末端区域的 B3 DNA 结合结域（DBD）、位于 C 末端二聚化结构域（CTD）和位于二者之间的行使激活或抑制能的中间结构域（MR）（Xing et al., 2011）。通过 PROSITE 和 PLAZA 在线软件检索和分析草莓的 ARF 蛋白质序列，图 3显示了 12 个 FvARF 蛋白质结构域的位置分布。所有 FvARF 均包含 B3-DNA 结合构域（DBD）和中间结构域（MR）。除了 ARF3，ARF17 和 ARF18 之外，FvARF列均含有 C 末端的 CTD 结构域。通过对 FvARFs 系统进化树分析发现，同一进化分枝中总是具有相似的结构，但是有些基因在同一分组中含有不同的基因结构。其，三个 FvARFs（FvARF3，FvARF17 和 FvARF18）具有截短的 CTD 结构域，它分布在进化树的组 I 和组 II 中。到目前为止，草莓中尚未发现仅包含一个结构域的vARF 基因（图 3）。

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