荔枝中环状小RNA分子的特性鉴定与分析
发布时间：2020-08-10 22:36
【摘要】：作为我国南方的主要栽培果树之一,荔枝在果树产业中占据重要地位。而荔枝上病虫害的频繁发生,给荔枝产业的健康发展带来严重的经济损失。然而,目前尚有许多病害的病原物尚不明确。通过对开放的转录组数据进行挖掘和分析,本研究在荔枝转录组数据中发现了一种小环状RNA分子,并对其分子生物学特征和发生分布情况进行了研究。主要结果如下:1.对NCBI上已经公布的转录组数据进行分析,在荔枝转录组数据中发现4条拼接序列(transcriptome shotgun assembly, TSA)中可能包含小环状RNA分子信息。进一步分析表明,该小环状RNA分子序列可能是苹果锈果类病毒属的序列。利用苹果锈果类病毒属的通用引物扩增获得200 bp的产物,所获序列与原始TSA拼接序列完全一致,从而证明该环状小RNA分子可能是一种类病毒的序列。2.设计背向引物,扩增获得该类病毒的全长为304nt,并且包含在TSA序列GBRI01043443内。序列多样性分析发现该类病毒有6个位点的碱基差异,序列相对保守。二级结构预测为棒状,符合马铃薯纺锤块茎类病毒科的二级结构特征,且保守结构域序列与苹果锈果类病毒属相似。因此,推测为该属类病毒,并将其暂时命名为荔枝类病毒(lychee viroid-like RNA, LVd-like RNA)。3.利用连续聚丙烯酰胺凝胶电泳和杂交验证LVd-like RNA的环状分子特性,同时证实其分子大小介于马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)和啤酒花矮化类病毒(hop stuntviroid,HSVd)之间,且更接近 HSVd。4.系统发育分析发现,LVd-like RNA属于马铃薯纺锤块茎类病毒科苹果锈果类病毒属,与葡萄潜隐类病毒(Grapevine latent viroid, GLVd)的亲缘关系最近,其次是柑橘类病毒VI (Citrus viroid VI,CVd VI)。5.制备LVd-like RNA的全长探针,通过杂交检测调查其发生分布情况。调查的146份样品中,中国有71份样品,其中54份为阳性样品,阳性率达到76%;而在法国的75份样品中,未检测到阳性样品。制备包含LVd-like RNA的表达载体的农杆菌菌液和体外转录产物,用两种方式接种常规草本和木本植物,并在接种后2～4个月内进行分子生物学检测,均未获得阳性样品。以上结果表明,目前LVd-like RNA仅能从中国荔枝资源圃中检测到。6.以苹果锈果类病毒属的通用引物进行克隆PCR,测序后发现1个CVd VI克隆和7个柿子类病毒2 (Persimmon viroid 2, PVd 2)克隆,说明CVd VI和PVd 2也可能存在于荔枝样品中。用15%的非变性PAGE凝胶电泳分离由上述通用引物扩增获得的PCR产物,可以同时检测到三种病原物的存在,从而建立了同时检测CVdVI, PVd2和LVd-likeRNA的技术体系。在本研究中,通过分析TSA的序列和分子生物学特点证明小环状RNA分子本质是一种类病毒,命名为荔枝类病毒,同时发现CVd VI和PVd 2也可能存在于荔枝中,并建立了这三种病原物的检测体系。荔枝类病毒的发现为类病毒的研究提供了新的资源,同时为荔枝的病害诊断和研究提供理论借鉴。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.67
【图文】：
树皮灰黑色。花序顶生，阔大，多分枝；花梗纤细，长约２？４邋ｍｍ，有时粗而短；萼被金逡逑黄色短绒毛；雄蕊６？７个，有时８个，花丝长约４邋ｍｍ；子房密覆小瘤体和硬毛。果卵圆形或近逡逑球形，长２？３．５邋ｃｍ，成熟时通常为暗红色至鲜红色；种子全部被肉质假种皮包裹（图１－１），属于逡逑非呼吸跃变型水果（Ａｋａｍｉｎｅ，邋１９７３）。逡逑’’姻逡逑图ｉ－ｉ荔枝的各个组织形态逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ邋ｆｏｒ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｏｆ邋ｌｙｃｈｅｅ逡逑Ａ、Ｂ：荔枝花；Ｃ、Ｄ：荔枝果实；Ｅ：荔枝根茎部位；Ｆ：荔枝叶片；图片来自中国植物志图库。逡逑１逡逑
１９７６年Ｓａｎｇｅｒ等人通过５％的ＰＡＧＥ检测接种和未接种黄瓜白果类病毒（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ邋ｐａｌｅ邋ｆｒｕｉｔ逡逑ｖｉｒｏｉｄ，邋ＣＰＦＶｄ）的番茄叶片总ＲＮＡ，分离到类病毒的条带，并通过目的条带回收再接种，进一步逡逑证明了该类病毒是引起黄瓜上症状的病原物（Ｓａｎｇｅｒ，邋１９７６）（图１－６）。同时利用超速离心的方法，逡逑分析不同类病毒的沉降系数，确定了邋ＣＰＦＶｄ邋（后来命名为Ｈｏｐｓｔｕｎｔｖｉｒｏｉｄ）的分子量为ｌ．ｌｘｌＯ５，逡逑相橘裂皮类病毒（Ｃｉｔｒｕｓ邋ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ邋ｖｉｒｏｉｄ，邋ＣＥＶｄ）的分子量为邋１．１９＞＜ｌ0５，ＰＳＴＶｄ邋的分子量为邋１．２７＞＜１0５。逡逑利用热力学变性的方法证明类病毒具有很高的热力学稳定性，可以形成大量的碱基互补配对。在逡逑变性和非变性条件下类病毒分子的沉降系数变化证明了类病毒的单链ＲＮＡ分子特性。用摩擦系逡逑数计算沉降系数时，类病毒与转运ＲＮＡ邋（ｔＲＮＡ）的比较，证明类病毒可以形成共价闭合环状结逡逑构，并在电子显微镜下观察变性和未变性条件下类病毒的分子形态，进一步说明类病毒的单链环逡逑状分子特性（Ｓａｎｇｅｒ，邋１９７６）（图邋１－７）。逡逑６逡逑
邋２０１３；邋Ｗｕ，２０１２；邋Ｚｈａｎｇ，邋２０１４ｂ）。因此，类病毒的种类和数量在不断增加。作为最小的病原物，逡逑类病毒既没有蛋白质的包被也没有庞大的基因组，基因组仅由单链ＲＮＡ组成，且基因组大小在逡逑２４６？４０１邋ｎｔ之间，体现了生物进化过程中遗传物质的多样性（图１－８）。逡逑Ｉ邋＇邋ｉ，邋＾ｔｉｃｕｍ邋ａｅｓｔｆｖｕｍ邋一邋１６．０００．０００．０００逦■－象逡逑ｒ逦２．９00．000．00０—？？邋Ｈｏｍｏ邋ｓａｐｉｅｎｓ逡逑ｍｍ逦ｎ逡逑＾逦１逦灥}卞五危粒颍幔猓椋洌铮穑螅椋箦义希樱幔悖悖瑁幔颍铮恚悖澹箦澹埃担埃埃埃埃板义希悖澹颍澹觯椋螅椋幔邋义希矗罚玻埃埃埃板邋五危牛螅悖瑁澹颍椋悖瑁椋徨澹悖铮欤戾义希郏颍海常校蓿殄巍觯龋殄义希馘危叔澹校瑁簦铮穑椋幔螅恚徨邋五危樱欤辏眩眩彦义希叔五五五五五五义希浚澹澹赍巍俊掊义希椋椋椋ｅ逡弧瑰危哄义稀诲澹粒悖簦澹睿铮觯椋颍觯箦巍澹常担剩场垮义希板蹇у澹樱Γ隋义希儒危郑椋颍铮欤溴义贤迹保富蜃榇笮〉牡萁邓承蝈义希疲椋纾澹保稿澹模澹螅悖澹睿洌椋睿珏澹螅悖幔欤邋澹铮驽澹纾澹睿铮恚椋沐澹螅椋邋义仙鲜龅幕蜃榇笮〕死嗖《竞褪删逵茫遥危帘硎疽酝猓溆嗟幕蜃榫茫模危帘硎尽Ｆ渲行÷蟮幕蜃槭且诲义细鼋浦怠Ｉ舷滦橄叻直鸨硎鞠赴氩《局浜筒《居肜嗖《局涞慕缦撸ǎ拢铮颍澹螅澹玻埃保担ｅ义希桑茫裕值淖钚卤ǜ嫦允荆徽矫睦嗖《局挥校常仓帧０凑绽嗖《镜男蛄刑卣鳌⒍督峁瑰义喜钜臁⒏粗品绞健⒏粗莆恢靡约霸诮械奈恢玫忍氐
本文编号：2788704
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.67
【图文】：
树皮灰黑色。花序顶生，阔大，多分枝；花梗纤细，长约２？４邋ｍｍ，有时粗而短；萼被金逡逑黄色短绒毛；雄蕊６？７个，有时８个，花丝长约４邋ｍｍ；子房密覆小瘤体和硬毛。果卵圆形或近逡逑球形，长２？３．５邋ｃｍ，成熟时通常为暗红色至鲜红色；种子全部被肉质假种皮包裹（图１－１），属于逡逑非呼吸跃变型水果（Ａｋａｍｉｎｅ，邋１９７３）。逡逑’’姻逡逑图ｉ－ｉ荔枝的各个组织形态逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ邋ｆｏｒ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｏｆ邋ｌｙｃｈｅｅ逡逑Ａ、Ｂ：荔枝花；Ｃ、Ｄ：荔枝果实；Ｅ：荔枝根茎部位；Ｆ：荔枝叶片；图片来自中国植物志图库。逡逑１逡逑
１９７６年Ｓａｎｇｅｒ等人通过５％的ＰＡＧＥ检测接种和未接种黄瓜白果类病毒（Ｃｕｃｕｍｂｅｒ邋ｐａｌｅ邋ｆｒｕｉｔ逡逑ｖｉｒｏｉｄ，邋ＣＰＦＶｄ）的番茄叶片总ＲＮＡ，分离到类病毒的条带，并通过目的条带回收再接种，进一步逡逑证明了该类病毒是引起黄瓜上症状的病原物（Ｓａｎｇｅｒ，邋１９７６）（图１－６）。同时利用超速离心的方法，逡逑分析不同类病毒的沉降系数，确定了邋ＣＰＦＶｄ邋（后来命名为Ｈｏｐｓｔｕｎｔｖｉｒｏｉｄ）的分子量为ｌ．ｌｘｌＯ５，逡逑相橘裂皮类病毒（Ｃｉｔｒｕｓ邋ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ邋ｖｉｒｏｉｄ，邋ＣＥＶｄ）的分子量为邋１．１９＞＜ｌ0５，ＰＳＴＶｄ邋的分子量为邋１．２７＞＜１0５。逡逑利用热力学变性的方法证明类病毒具有很高的热力学稳定性，可以形成大量的碱基互补配对。在逡逑变性和非变性条件下类病毒分子的沉降系数变化证明了类病毒的单链ＲＮＡ分子特性。用摩擦系逡逑数计算沉降系数时，类病毒与转运ＲＮＡ邋（ｔＲＮＡ）的比较，证明类病毒可以形成共价闭合环状结逡逑构，并在电子显微镜下观察变性和未变性条件下类病毒的分子形态，进一步说明类病毒的单链环逡逑状分子特性（Ｓａｎｇｅｒ，邋１９７６）（图邋１－７）。逡逑６逡逑
邋２０１３；邋Ｗｕ，２０１２；邋Ｚｈａｎｇ，邋２０１４ｂ）。因此，类病毒的种类和数量在不断增加。作为最小的病原物，逡逑类病毒既没有蛋白质的包被也没有庞大的基因组，基因组仅由单链ＲＮＡ组成，且基因组大小在逡逑２４６？４０１邋ｎｔ之间，体现了生物进化过程中遗传物质的多样性（图１－８）。逡逑Ｉ邋＇邋ｉ，邋＾ｔｉｃｕｍ邋ａｅｓｔｆｖｕｍ邋一邋１６．０００．０００．０００逦■－象逡逑ｒ逦２．９00．000．00０—？？邋Ｈｏｍｏ邋ｓａｐｉｅｎｓ逡逑ｍｍ逦ｎ逡逑＾逦１逦灥}卞五危粒颍幔猓椋洌铮穑螅椋箦义希樱幔悖悖瑁幔颍铮恚悖澹箦澹埃担埃埃埃埃板义希悖澹颍澹觯椋螅椋幔邋义希矗罚玻埃埃埃板邋五危牛螅悖瑁澹颍椋悖瑁椋徨澹悖铮欤戾义希郏颍海常校蓿殄巍觯龋殄义希馘危叔澹校瑁簦铮穑椋幔螅恚徨邋五危樱欤辏眩眩彦义希叔五五五五五五义希浚澹澹赍巍俊掊义希椋椋椋ｅ逡弧瑰危哄义稀诲澹粒悖簦澹睿铮觯椋颍觯箦巍澹常担剩场垮义希板蹇у澹樱Γ隋义希儒危郑椋颍铮欤溴义贤迹保富蜃榇笮〉牡萁邓承蝈义希疲椋纾澹保稿澹模澹螅悖澹睿洌椋睿珏澹螅悖幔欤邋澹铮驽澹纾澹睿铮恚椋沐澹螅椋邋义仙鲜龅幕蜃榇笮〕死嗖《竞褪删逵茫遥危帘硎疽酝猓溆嗟幕蜃榫茫模危帘硎尽Ｆ渲行÷蟮幕蜃槭且诲义细鼋浦怠Ｉ舷滦橄叻直鸨硎鞠赴氩《局浜筒《居肜嗖《局涞慕缦撸ǎ拢铮颍澹螅澹玻埃保担ｅ义希桑茫裕值淖钚卤ǜ嫦允荆徽矫睦嗖《局挥校常仓帧０凑绽嗖《镜男蛄刑卣鳌⒍督峁瑰义喜钜臁⒏粗品绞健⒏粗莆恢靡约霸诮械奈恢玫忍氐
本文编号：2788704
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