蜡梅抗寒相关转录因子CpICE1a、CpICE1b和CpDREB1的克隆及功能初探

发布时间：2020-08-12 05:26

【摘要】：蜡梅(Chimonanthus praecox L.)为蜡梅科蜡梅属植物,以“耐寒、耐旱、耐剪”而著称,花期12月至翌年2月,傲雪屹立,凌寒怒放。花是植物体对抗外界逆境最弱的部分,但是蜡梅花却盛开在严寒的冬季,推测蜡梅在抵御外界低温的调控路径中,可能存在一些功能比较特别的调控因子,目前,低温信号途径研究得比较清楚的是CBF信号转导途径。CBF/DREB1基因位于CBF途径的中心位置,调控表达受到各种信号因子的影响,在低温应答途径中起到“总开关”的作用,ICE1基因是CBF的上游调控因子,可以通过结合CBF的启动子区调控下游基因的表达,目前蜡梅抗寒性的研究主要集中在功能基因上,基于ICE1和CBF/DREB1基因在植物应答低温路径上的重要作用,因此这两类转录因子的研究对了解蜡梅的抗寒机制有重要的意义。基于本实验室之前发现的2个ICE类的转录因子CpICE11和CpICE12,本实验的主要内容是克隆具有完整结构域的CpICE1a、CpICE1b基因和1个DREB1类基因—CpDREB1基因,并分析其功能,一方面运用实时定量技术分析CpICE1a、CpICE1b和CpDREB1在蜡梅各个器官、花发育的不同阶段和低温条件下的表达量变化,然后构建表达载体,运用转基因的手段将这三个基因转入烟草中进行功能探究,另一方面克隆CpDREB1的启动子序列,为之后研究CpICE1a、CpICE1b与CpDREB1的互作做基础,主要结果如下:(1)克隆CpICE1a、CpICE1b和CpDREB1的开放阅读框,得到了CpICE1a、CpICE1b和CpDREB1在gDNA中全长,对基因结构进行分析,发现CpDREB1无内含子,CpICE1a和CpICE1b基因包含2个内含子、3个外显子,在结构上,与拟南芥、苹果、梅花、葡萄中ICE1类基因的3个内含子、4个外显子不同,具有本物种的特殊性。(2)克隆得到CpDREB1的启动子序列431bp,其中存在一个MYC结合位点和多个胁迫诱导调控作用位点,如:响应茉莉酸甲酯(MeJA)、赤霉素(GA)和水杨酸(SA)的作用元件。(3)利用qPCR技术,检测分析CpICE1a、CpICE1b与CpDREB1转录因子在蜡梅不同部位、花发育的不同阶段和低温条件下的表达情况。结果表明,CpICE1a、CpICE1b与CpDREB1在蜡梅的茎、叶、花、果及花发育的不同阶段都有不同程度的表达,这三个基因都能响应低温胁迫,但是两类基因的表达模式不同,推测在蜡梅开花阶段为适应低温环境,维持自身生长,可能存在反馈调节机制。(4)构建CpICE1a、CpICE1b与CpDREB1表达载体,并转入烟草中,分别得到转基因烟草47株、47株和44株,在低温处理探究基因功能方面,对长势一致的野生型和转基因烟草进行4度处理24h后,野生型失水萎蔫程度比转基因植株的严重,4℃处理3h后,部分转基因单株处理前后MDA含量的变化幅度比野生型小,其转入的目的基因的表达量也高于其他单株,抗寒能力得到提高,通过半定量分析,在自然生长条件下,转CpICE1a和CpICE1b基因可以促进烟草中NtLEA5基因的表达,而同样为LEA类基因的NtERD10D的表达几乎不变,而在转CpDREB1的烟草中,即使CpDREB1的表达量很高,但是这两个基因的表达没有明显的变化,说明CpICE1a和CpICE1b的导入,在正常生长条件下就可以提高烟草对逆境的抵抗能力,而CpDREB1在正常生长条件下,可能不影响这两个抗逆基因的表达。低温处理后,在转CpICE1a的烟草中,CpICE1a和NtERD10D的表达量升高,而在CpDREB1的转基因烟草中,低温不影响CpDREB1和NtERD10D的表达,说明在转基因烟草中,低温可以诱导CpICE1a的表达,并且影响其对下游功能基因的调控,而CpDREB1不受低温诱导,而且NtERD10D可能不是CpDREB1在烟草中的下游靶基因,在冷胁迫的情况下,无论在野生型还是CpICE1a和CpDREB1的转基因植株中,NtLEA5的表达都明显升高,半定量的结果,显示不出与野生型的区别,无法确定转基因对NtLEA5的影响,需要后续的实验验证。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S685.99
【图文】：

植物,低温,外界温度,负调控因子

1 植物激素通过调控 CBF 参与低温胁迫（Barrero-Gil and Salina1 Current model of CBF Regulation by Phytohormones during Cold5) 植物开花诱导与 CBF：在适当的时间开花是植物繁育后代的重是由内源信号和环境因素组成的复杂的遗传网络所调控，拟南芥因 SOC1（Suppressor of Overexpression of Constans1）编码 MADS与多个开花诱导途径，对拟南芥突变体的微阵列分析和后期试验基因 SOC1 在低温响应过程中，可以直接作用于 CBFs，对该类基。FLC（Flowering Locus C）是位于 SOC1 上游的一个负调控因子花决定调节基因之间的反循环模型中起重要作用，如图 2 所示：外界温度低，低温信号促进了 CBFs 的表达，一方面提高了植物力，一方面促进了 FLC 的表达，推迟了开花时间，FLC 的表达量C1 的表达，进而解除了 SOC1 对 CBFs 的抑制作用，CBFs 的表达得后期，外界温度升高，植物通过 SOC1 的表达抑制 CBFs 的表达诱导植物开花（Seo et al 2009）。

植物激素,低温胁迫

物激素通过调控 CBF 参与低温胁迫（Barrero-Gil and Srrent model of CBF Regulation by Phytohormones during物开花诱导与 CBF：在适当的时间开花是植物繁育后代内源信号和环境因素组成的复杂的遗传网络所调控，拟SOC1（Suppressor of Overexpression of Constans1）编码 M个开花诱导途径，对拟南芥突变体的微阵列分析和后期 SOC1 在低温响应过程中，可以直接作用于 CBFs，对该LC（Flowering Locus C）是位于 SOC1 上游的一个负调控定调节基因之间的反循环模型中起重要作用，如图 2 所温度低，低温信号促进了 CBFs 的表达，一方面提高了一方面促进了 FLC 的表达，推迟了开花时间，FLC 的表表达，进而解除了 SOC1 对 CBFs 的抑制作用，CBFs 的表，外界温度升高，植物通过 SOC1 的表达抑制 CBFs 的植物开花（Seo et al 2009）。

模式图,信号转导途径,模式图

蛋白的活性继而调控 CBF 的表达，因此可以推测低温可以使植物产生一些类似 P信号分子，这些信号分子一方面可能通过与 SIZ1 结合，影响 SIZ1 的活性，SUM化 ICE1 蛋白，ICE1 的 SUMO 化可以抑制 HOS1 介导的 ICE1 的泛素化，增强了 IC蛋白的稳定性。另一方面信号分子参与到 ABA 信号途径，与 ABI1 结合，解除 AB对于 OST1 活性的抑制，激活后的 OST1 可以磷酸化 ICE1，激活其转录活性，然ICE1 蛋白结合到 CBF 启动子上的 MYC 结合作用位点上，促进 CBFs 的表达，接来CBFs又可以与下游功能基因启动子上的CRT/DRE元件结合启动功能基因的表增加植物对冷冻胁迫的抵抗能力。OST1 还可以与 HOS1 互作，抑制 ICE1 和 HO的相互作用，增强 ICE1 蛋白的稳定性，低温调控是一个精细的调控方式，ICE1 速的激活是由于 SIZ1 介导的 SUMO 化，随后 ICE1 的失活是由于 HOS1 介导的泛化和降解。低温诱导 CBF 转录水平快速、明显的增加，在 2-3h 达到最大值，随降低到和常温下植物 CBF 转录水平几乎相当。SIZ1—HOS1 系统有助于上调低温导基因表达的同时阻止了潜在有害作用下的失控诱导（霍晨敏和汤文强 2016Agarwal et al 2017）。

【参考文献】