草莓ARF4基因沉默载体构建及功能缺失分析

发布时间：2020-08-14 22:29

【摘要】：生长素响应因子ARF(auxin response factor)是一类转录因子,通过调控生长素响应基因的表达来调节植物生长发育。ARF4是ARF家族成员,目前关于ARF4基因的研究仅局限于拟南芥和番茄等植物,在草莓中的相关研究报道甚少。本文通过构建FaARF4-GFP载体来明确FaARF4蛋白的细胞定位。通过构建草莓FvARF4基因沉默载体,旨在进一步明确ARF4基因缺失对草莓植株生长发育的影响。主要结果如下:1.首先从二倍体‘Ruegen’草莓中扩增FvARF4基因编码区序列,全长为2409bp,编码802个氨基酸。与二倍体森林草莓基因组中对应序列相似度为99.79%;与八倍体栽培草莓FaARF4氨基酸序列一致性为99%。通过序列分析选择333bp特异性序列作为构建沉默表达载体的目的片段,并分别扩增正反沉默片段。2.通过SYBR染料法qRT-PCR检测了森林草莓‘Ruegen’不同器官中ARF4的相对表达量,结果显示在叶柄、花和叶中ARF4的表达量最高,在根和果实中次之。3.利用实验室已有的八倍体‘艳丽’草莓FaARF4编码区全长序列,扩增不含终止子的2400bp的FaARF4序列。以pRI101-GFP为骨架载体,以XbaⅠ/SalⅠ为酶切位点,成功构建ARF4-GFP融合载体。对ARF4蛋白进行亚细胞定位,发现其定位在细胞核内,属于核蛋白。4.以pART27为表达载体、pKANNBAL载体为中间载体,利用XhoⅠ/EcoRⅠ和HindⅢ/XbaⅠ为酶切位点,首先将长度333bp的ARF4正反沉默片段插入连接到pKANNBAL上。然后利用NotⅠ进行单酶切,将带有ARF4沉默片段的序列与pART27载体连接,最终成功构建草莓FvARF4基因沉默载体,命名为pRNAi-ARF4。5.采用农杆菌介导的‘叶盘法’侵染草莓叶片,将pRNAi-ARF4载体侵染到二倍体森林草莓‘Ruegen’中。通过SYBR染料法qRT-PCR定量检测转基因植株中ARF4的相对表达量,结果显示在6株转基因植株中ARF4表达量均明显下调。6.通过表型观察,发现FvARF4基因沉默植株叶片形态没有发生明显变化,而表现出晚花现象和花发育缺陷:花瓣不能完全展开。转基因植株中果实发育易出现畸形,并且这些表型能够遗传到T1代植株中。在观察T1代植株根系时发现FvARF4基因沉默T1代植株的侧根数显著少于对照。7.通过检测转基因植株中表型相关基因的表达量,发现AP1,FT,SOC1和SPL3的表达量下降,FUL和ARF3的表达量没有明显变化。推测ARF4可能通过调控上述基因发挥作用。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S668.4
【图文】：

示意图,生长素,信号转导途径,植物

信号激活基因的过程很简单，仅仅是生长素转运到细胞中，然后ux/IAA 阻遏物募集到生长素占据到/IAA 阻遏物，然后通过也可以对 ARFs传导过程中：当uxRE 促进生长素响应基因的抑制作用uilfoyle and Hagen, 2012途径使 Aux/IAA其激活(Guilfoyle and Hagen, 2007反应(Gray et al., 2001因的激活和抑制F，ARF-Aux/IAA相互作用，隔离或阻止特定直接与其他转录激活因子或抑制因子lfoyle and Hagen, 2007TIR1 受体上，随后通过泛素ARF 激活剂对生长素响应基因起到激活的活性进行调节(Simonini et al., 2016; 李艳林等传导过程中：当内源生长素浓度较低时，Aux/IAA 与 ARF(Tiwari et al., 20032012; Guilfoyle, 2015)；当生长素浓度升到一IAA 阻遏物降解，同时释放 ARFs，减弱了生长素应Guilfoyle 2007;Salehin et al., 2015)，随后植物Gray 2001)。ARF 和 Aux/IAA 蛋白之间的相互作用，因的激活和抑制作用，但除此之外也可能发生额外的调节方式。IAA 和 Aux/IAA-Aux/IAA 相互作用或 ARFARF 或 Aux/IAA 蛋白到达其靶位点直接与其他转录激活因子或抑制因子直接相互作用，以调节生长lfoyle 2007; Shin et al., 2007; Guilfoyle, 2015)。通过Tiwari 2003; Gu，但除此之外也可能发生额外的调节方式。和 Au蛋白到达其靶位点调节生长

过程图,表达载体构建,过程,载体

Fig.2The process of vector constructionof pRNAiF4 沉默载体的构建的提取 pKANNBAL 载体养基上进行活化 Amp（100 μg·mL（含相同的抗生素）培养粒、pGM-ARF4F4 正向沉默片段与NNBAL 载体和（pKANNBAL）图2 pRNAi-ARF4表达载体构建过程The pRNAi-ARF4载体和 pART-27 载体的大肠杆菌分别在含 Ka养基上进行活化；将带有 pGM-ARF4F 载体和 pGM-ARF4mL-1）的 LB 固体培养基上进行活化，分别（含相同的抗生素）培养。使用质粒提取试剂盒提取 pKAF 质粒和 pGM-ARF4R 质粒，详细步骤按照pKANNBAL 载体连接和 pGM-ARF4F 载体质粒分别用 EcoRⅠ/XhoⅠ进15 μl 底物（pGM-ARF4F） 15 ARF4，分别选，详细步骤按照进

序列,验标,基因编码区,条带

验标准phoretic result增区序列因组区rRNA 与 18S rRNA 条带相比非常明亮验标准。3‘Ruegen’草莓总 RNA 的电泳结果of total RNAof‘Ruegen’strawb增因组 cDNA 作为模板，以表 2 中的 ARF区序列，得到一条约 2400bp 左右的片strawb左右的片

【参考文献】