SlZF3调控开花时间和FolB2调控植物根发育的机理研究

发布时间：2020-08-21 01:08

【摘要】：番茄(Solanum lycopersicum)是全球最重要的蔬菜之一,在我国蔬菜产业中同样重要。在基础研究方面,番茄和拟南芥均是重要的模式植物。利用番茄和拟南芥研究植物开花以及根的发育调控机制能帮助我们深入认识植物的发育,同时为农作物的遗传改良提供重要的理论基础。在本研究前期工作中发现,超表达番茄C2H2型锌指蛋白Sl ZF3可以提高植物的耐盐性,该锌指蛋白C端含有EAR-motif,具有转录抑制活性。同时,我们还观察到Sl ZF3超表达番茄和拟南芥在发育方面也发生了明显的变化,如矮化、叶片与茎秆之间夹角变小、开花延迟等。在本研究中,我们针对Sl ZF3调控开花时间的分子机制进行了较为深入的研究。此外,我们将Sl ZF3异位超表达到拟南芥的研究中发现了一个短根突变体folb2,通过研究发现该突变体非T-DNA插入导致,而是自然突变。通过图位克隆发现,突变体中At Fol B2的启动子和5`UTR区缺失了61bp,造成At Fol B2转录水平显著下降,并导致根的发育缺陷。At Fol B2编码二氢新碟呤醛缩酶,位于叶酸合成途径上游。在本研究中,我们较为深入的研究了At Fol B2如何调控植物主根和不定根的发育。主要研究结果如下:1.在番茄和拟南芥中超表达Sl ZF3可以显著延迟开花时间,而RNA干涉Sl ZF3能够使番茄提早开花。同时,在拟南芥中超表达Sl ZF3的直系同源基因ZAT12也可以显著延迟开花时间,而RNA干涉ZAT12能够显著促进拟南芥开花。2.通过酵母双杂交和荧光素酶报告系统分析发现Sl ZF3与At CO直接互作。CoIP实验表明Sl ZF3与At CO在番茄中的同源蛋白Sl CO1直接互作,并且其EAR-motif对互作不是必须的。另外,遗传学证据也证明Sl ZF3与At CO是互作的。3.双荧光素酶实验表明,SlZF3可显著抑制AtFT启动子的活性,而At CO则可显著提高At FT启动子活性。Ch IP-q PCR实验表明,Sl ZF3或ZAT12可以结合在At FT启动子靠近5`UTR的区域。通过EMSA实验进一步发现,Sl ZF3和ZAT12可以分别结合到SFT和At FT启动子上的5’UTR Py-rich stretch和TCA顺式元件,但和单独一个顺式元件5’UTR Py-rich stretch或者TCA都不能结合。上述两个元件与At CO蛋白在拟南芥At FT启动子上的结合元件CORE2相邻,与番茄SFT启动子上的CORE2顺式元件距离76 bp。4.综合结果表明,Sl ZF3通过直接与CO互作以及结合到FT启动子上的两个顺式元件5`UTR Py-rich stretch和TCA而负调控植物开花。5.在ZF3异位表达的拟南芥株系中偶然发现的一个根系突变体folb2,该突变体主根生长受抑制,在茎基处产生1-2个不定根。PI以及I2-IK染色发现folb2突变体根尖分生区不完整。图位克隆发现At Fol B2启动子和5`UTR过渡区缺失了61 bp,该缺失造成At Fol B2转录水平显著下降。创建了folb2的功能互补材料(FC)和野生型背景的RNAi材料,发现互补材料中根系表型得到恢复,而RNAi材料的根系表型与folb2类似。同时也创建了At Fol B2在番茄中的同源基因Sl Fol B2的RNAi材料,其根系表型与folb2类似。6.LC-MS测定叶酸发现,四氢叶酸THF及其衍生物5-M-THF或者四氢叶酸前体DHF,在folb2突变体和RNAi材料中显著下降,而在互补系中含量恢复至野生型水平。在培养基中外源施加5-F-THF可以恢复folb2突变体的表型。在番茄Sl Fol B2 RNAi株系中,四氢叶酸THF及其衍生物(5-M-THF和5-FTHF)或者四氢叶酸前体DHF均显著下降。7.探讨了At Fol B2突变对生长素分布和信号响应途径的影响。转录组分析发现,生长素运输和信号响应基因显著下调,而生长素响应下游基因LBD41显著上调表达,q RT-PCR进一步验证了该结果。LC-MS测定Col-0、folb2和FC中叶片和根中生长素含量发现,尽管突变体folb2中的生长素含量降低了,但是功能互补系中的生长素水平和folb2相比无显著差异,因此生长素含量的变化不是folb2突变体表型缺陷的主要原因。利用报告系DR5:m GFP、PINs:GFP、WOX5:GFP以及DII:VENUS:YFP进行杂交调查报告基因表达,结果表明叶酸可以调控生长素向根尖极性运输以及生长素在根成熟区维管束和周围组织中的分布。8.遗传学证据表明,LBD41是At Fol B2的一个下游靶基因。在folb2突变体中干涉LBD41后,folb2突变体根缺陷表型恢复至野生型状态。综合研究表明,叶酸通过调控生长素的极性运输以及分布对根尖分生区的保持起着关键作用。它主要通过LBD41调控植物主根和不定根的发育。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S641.2
【图文】：

锌指蛋白,番茄

在菊花中有一个 B-BOX 型锌指蛋白 CmBBX24，干涉 CmBBX24 可以是超表达株系开花时间没有明显变化(Yang and Gao 2014)。番茄中，超表达 C2H2 类锌指蛋白 SlZFP2 可以促进番茄开花，进一SlZFP2 可以结合到 SFT 启动子上并激活 SFT 的表达，但是 RNA 干涉间没有明显变化，说明 SlZFP2 不是关键的番茄开花调控因子(Wen。在我们之前的研究中，利用对盐处理番茄材料进行转录组分析发现理响应的转录因子，其中一个为 SlZF3 (GenBank accession no. DY523accession no. Solyc06g075780) (Ouyang et al., 2007)。C2H2 型锌指蛋白系同源的 ZAT12 可以通过与 CSN5B 互作提高番茄和拟南芥的耐盐性超表达 SlZF3/ZAT12 对番茄和拟南芥发育方面也产生显著影响，包括，但是具体的分子机制还不清楚(Li et al 2017a)。

锌指蛋白,负调控,拟南芥,番茄

图 1.2 C2H2 型锌指蛋白 SlZF3 负调控番茄和拟南芥开花时间。a, 野生型 Alisa Craig、SlZF3 超量表达（OE-8 和 OE-37）和 RNAi 株系（RNAi-6 和 RNAi-30）开花表型（3 个月苗龄）；b, 番茄各株系前三个花序的开花时间；c, e, 野生型拟南芥 Col-0、

差异表达基因,生物学,野生型,材料

图 1.3. ZAT12 超表达材料的 RNA-seq 分析以及 SlZF3在花器官中的表达。a, b, ZAT12 超表达材料 OX-10 和 OX-3 与野生型 Col-0 之间的差异表达基因数，每个样品 2个生物学重复；c, d, AtFT在 OX-10 和 OX-3 系中下调表达。e, qRT-PCR 分析 Col-0, OX-10 和

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