苹果蔗糖非发酵相关蛋白激酶基因MpSnRK2.10和MdCIPK03在非生物逆境应答中的功能研究
发布时间：2020-08-22 21:02
【摘要】：由蛋白磷酸酶和蛋白激酶所催化的蛋白质可逆磷酸化是真核生物体内信号转导的主要机制。蔗糖非发酵相关蛋白激酶(sucrose nonfermenting-1-related protein kinases,SnRK)亚家族2(SnRK2)和亚家族3(SnRK3)是植物特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。SnRK2是植物脱落酸(ABA)信号通路的必要组件和正调控因子,同时也是渗透胁迫应答的主要参与者;SnRK3也被称作类钙调磷酸酶B-亚基(calcineurin B-like,CBL)蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase,CIPK),是植物在逆境胁迫下维持离子平衡的主要调控者。苹果(Malus domestica)是世界上最重要的果树树种之一,而我国苹果主产区黄土高原地区频繁出现的干旱、盐渍和冻害等不利因素严重限制了其树体的生长发育、果实产量及品质形成。因此,研究苹果的SnRK2和SnRK3基因能够为了解苹果的抗逆分子机制和抗逆改良育种提供理论基础。本研究从苹果基因组中系统地分离鉴定SnRK2和SnRK3基因家族成员,对其序列特征进行分析,检测其在非生物逆境处理下的表达模式,从中选出两个基因MpSnRK2.10和MdCIPK03分别进行遗传转化获得过表达转基因植物,探究了转基因植物对非生物逆境的抗/耐性。获得的主要研究结果如下:1.苹果SnRK2基因家族的鉴定及表达分析在苹果基因组中筛选出14条完整的SnRK2核苷酸预测序列,它们能够编码12条推定的蛋白序列。基因染色体定位和同线性分析结果表明串联复制和节段性复制可能促进了苹果SnRK2基因家族的扩展。以苹果砧木富平楸子[Malus prunifolia(Willd)Borkh.]的cDNA为模板,经克隆测序,12条完整的苹果SnRK2编码序列(MpSnRK2.1—MpSnRK2.12)均被核实。系统发育分析表明MpSnRK2可以分为4组,各组内成员具有相似的基因结构和保守结构域。MpSnRK2各成员在富平楸子不同组织中的表达模式有所差异。干旱、盐及ABA处理能够诱导部分家族成员在叶片中的表达上调,预示着这些基因可能在苹果对非生物逆境的响应中具有功能。2.过表达MpSnRK2.10增强转基因植物的抗旱性和耐盐性将MpSnRK2.10转化拟南芥和GL-3苹果产生过表达转基因植株。在正常培育条件下过表达MpSnRK2.10对植物的生长发育无影响。在干旱和盐处理条件下,转基因植株与野生型植株(WT)相比外观形态损伤较轻,胁迫损害相关生理指标改善,表明转基因植株的抗旱和耐盐能力更强。此外,转基因苹果对由ABA引起的生长抑制更敏感。在ABA、甘露醇和NaCl处理下,胁迫诱导基因MdRAB18、MdRD22和MdRD29B在转基因苹果中的表达量高于野生型植株。这些结果说明在逆境条件下,过表达MpSnRK2.10可能通过加强ABA信号输出从而增强转基因植株的抗旱性。3.苹果CIPK(SnRK3)基因家族的鉴定及表达分析在苹果基因组中筛选出44条完整的CIPK核苷酸预测序列,它们能够编码32条推定的蛋白序列(MdCIPK01—MdCIPK32)。基于MdCIPK基因的染色体定位和同线性分析,发现了10对串联复制序列和11对旁系同源序列,由此推测串联复制和节段性复制事件可能极大地促进了苹果CIPK基因家族的扩展。以‘金冠’苹果(Malus domestica cv.Golden Delicious)的cDNA为模板,经克隆测序,19条完整的苹果CIPK编码序列得到核实。蛋白序列比对分析显示所有的MdCIPK都具有高度保守的ATP结合位点、激酶活化环、NAF及PPI序列元件(Motif)。在系统发育分析中,12个MdCIPK聚在多内含子类群,20个MdCIPK聚在寡内含子类群,大部分MdCIPK以紧邻成对的聚集方式分布于各分支中。在干旱、NaCl、ABA及低温处理下,多数MdCIPK的表达下调,但MdCIPK03的表达显著上调,预示着该基因可能在苹果的非生物逆境应答中具有重要作用。4.过表达MdCIPK03增强转基因拟南芥的抗旱性、耐盐性和耐寒性将MdCIPK03转化拟南芥产生过表达转基因植株。在正常培育条件下过表达MdCIPK03对拟南芥的生长发育无影响。在干旱、盐及冷冻处理下,转基因植株与WT相比外观形态损伤较轻,胁迫损害相关生理指标改善,存活率升高,表明转基因植株对非生物逆境的对抗/耐受能力增强。这些结果预示着MdCIPK03可能对苹果的非生物逆境应答具有正调控作用。此外,MdCIPK03在酵母双杂交试验中能与苹果MdCBL1、MdCBL3、MdCBL4和MdCBL5互作,说明MdCIPK03的活性及功能可能是由这些钙结合蛋白调控的。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S661.1
【图文】：
西北农林科技大学博士学位论文表达量在硝态氮处理时下调；异源表达 MhSnRK1 的转基因番茄与野生型对照相比，其叶片和成熟果实中的可溶性糖及淀粉含量升高（Li et al. 2010）。MdSnRK1.1 能够磷酸化 MdJAZ18（JA 信号通路抑制因子）以促进其由 26S 蛋白酶体介导的降解从而解除其对苹果碱性-螺旋-环-螺旋（basic helix loop helix，bHLH）类转录因子 MdbHLH3 的抑制，由此释放的 MdbHLH3 则激活相关调控和结构基因的表达并最终促成花青素的生物合成（Liu et al. 2017）。对苹果 SnRK1 的研究表明了 SnRK1 在 JA 信号中的调控作用并揭示了蔗糖诱导类黄酮物质合成的分子机理。
图 1-2 SnRK2 的系统发育分类和结构示意图（Fujita et al. 2013）Fig. 1-2 Phylogenetic tree and domain structure of SnRK2 protein kinases：来自拟南芥、水稻、卷柏、苔藓、绿藻和其他维管植物 SnRK2 的激酶结构域及 Domain Ⅰ 用对建树（邻接法）。右图为 SnRK2 的功能区和结构域示意图及 ABA 和渗透胁迫对各个 SnRK2 活效应。ote: The kinase domain and the Domain Ⅰ of SnRK2 in Arabidopsis, rice, spikemoss, moss, green algnd other species of vascular plants were used for the alignment to create the neighbor-joinihylogenetic tree. The organization of the functional regions and conserved domains is shown in cartoormat on the right. The activation of each SnRK2 by ABA or osmotic stress is indicated.1.3.2 SnRK2 与 ABA 信号通路1.3.2.1 第三亚类 SnRK2 在 ABA 信号转导中的功能ABA 作为 种重要的植物激素在调控种子成熟、萌发、幼苗生长等 系列发育生理过程及控制多种非生物逆境响应中发挥关键作用（Fujii and Zhu 200Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 2006）。在早期的 ABA 信号通路研究中，研究者
图 1-3ABA 信号通路模式及核心元件的演化（Komatsu et al. 2013; Umezawa et al. 2010）Fig. 1-3 Evolutionary model of ABA signaling and the core components注：（A）小立碗藓（Physcomitrella patens）、江南卷柏（Selaginella moellendorffii）和拟南芥中 ABA信号通路核心组件的数目分别代表了其在苔藓植物、蕨类植物及被子植物中的数目。（B）苔藓植物的祖先（中）以依赖 ABA 的方式通过募集 PP2C 来调控先前存在的营养体脱水耐受（desiccatiotolerance，DT）信号通路（左），但 PP2C 位于 SnRK2 的下游发挥功能。在种子植物的祖先（右）中，SnRK2 则由 PP2C 严格监管，此种演变或许有益于对 SnRK2 日益增多的下游靶标的综合调控Note: (A) As representatives, component numbers of bryophyte, lycophyte and angiosperm were obtaifrom Physcomitrella patens, Selaginella moellendorffii and Arabidopsis thaliana, respectively. (B) ancestor of bryophytes (middle) recruited PP2C which action downstream of SnRK2 to control pre-existing pathway for vegetative desiccation tolerance (DT) (left) in an ABA-dependent manner. ancestor of seed plants (right) developed tight regulation of SnRK2 by PP2C, which enabled integrregulation of an increased number of signalling pathways downstream of SnRK2.
本文编号：2801145
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S661.1
【图文】：
西北农林科技大学博士学位论文表达量在硝态氮处理时下调；异源表达 MhSnRK1 的转基因番茄与野生型对照相比，其叶片和成熟果实中的可溶性糖及淀粉含量升高（Li et al. 2010）。MdSnRK1.1 能够磷酸化 MdJAZ18（JA 信号通路抑制因子）以促进其由 26S 蛋白酶体介导的降解从而解除其对苹果碱性-螺旋-环-螺旋（basic helix loop helix，bHLH）类转录因子 MdbHLH3 的抑制，由此释放的 MdbHLH3 则激活相关调控和结构基因的表达并最终促成花青素的生物合成（Liu et al. 2017）。对苹果 SnRK1 的研究表明了 SnRK1 在 JA 信号中的调控作用并揭示了蔗糖诱导类黄酮物质合成的分子机理。
图 1-2 SnRK2 的系统发育分类和结构示意图（Fujita et al. 2013）Fig. 1-2 Phylogenetic tree and domain structure of SnRK2 protein kinases：来自拟南芥、水稻、卷柏、苔藓、绿藻和其他维管植物 SnRK2 的激酶结构域及 Domain Ⅰ 用对建树（邻接法）。右图为 SnRK2 的功能区和结构域示意图及 ABA 和渗透胁迫对各个 SnRK2 活效应。ote: The kinase domain and the Domain Ⅰ of SnRK2 in Arabidopsis, rice, spikemoss, moss, green algnd other species of vascular plants were used for the alignment to create the neighbor-joinihylogenetic tree. The organization of the functional regions and conserved domains is shown in cartoormat on the right. The activation of each SnRK2 by ABA or osmotic stress is indicated.1.3.2 SnRK2 与 ABA 信号通路1.3.2.1 第三亚类 SnRK2 在 ABA 信号转导中的功能ABA 作为 种重要的植物激素在调控种子成熟、萌发、幼苗生长等 系列发育生理过程及控制多种非生物逆境响应中发挥关键作用（Fujii and Zhu 200Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki 2006）。在早期的 ABA 信号通路研究中，研究者
图 1-3ABA 信号通路模式及核心元件的演化（Komatsu et al. 2013; Umezawa et al. 2010）Fig. 1-3 Evolutionary model of ABA signaling and the core components注：（A）小立碗藓（Physcomitrella patens）、江南卷柏（Selaginella moellendorffii）和拟南芥中 ABA信号通路核心组件的数目分别代表了其在苔藓植物、蕨类植物及被子植物中的数目。（B）苔藓植物的祖先（中）以依赖 ABA 的方式通过募集 PP2C 来调控先前存在的营养体脱水耐受（desiccatiotolerance，DT）信号通路（左），但 PP2C 位于 SnRK2 的下游发挥功能。在种子植物的祖先（右）中，SnRK2 则由 PP2C 严格监管，此种演变或许有益于对 SnRK2 日益增多的下游靶标的综合调控Note: (A) As representatives, component numbers of bryophyte, lycophyte and angiosperm were obtaifrom Physcomitrella patens, Selaginella moellendorffii and Arabidopsis thaliana, respectively. (B) ancestor of bryophytes (middle) recruited PP2C which action downstream of SnRK2 to control pre-existing pathway for vegetative desiccation tolerance (DT) (left) in an ABA-dependent manner. ancestor of seed plants (right) developed tight regulation of SnRK2 by PP2C, which enabled integrregulation of an increased number of signalling pathways downstream of SnRK2.
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 陈学森;韩明玉;苏桂林;刘凤之;过国南;姜远茂;毛志泉;彭福田;束怀瑞;;当今世界苹果产业发展趋势及我国苹果产业优质高效发展意见[J];果树学报;2010年04期
相关博士学位论文 前5条
1 谢银鹏;苹果MdMYB88和MdMYB124转录因子在低温和干旱胁迫中的作用机理研究[D];西北农林科技大学;2018年
2 王娜;苹果YTH结构域RNA结合蛋白基因MhYTP1和MhYTP2的功能研究[D];西北农林科技大学;2017年
3 李超;外源褪黑素和多巴胺对苹果抗旱耐盐性的调控功能研究[D];西北农林科技大学;2016年
4 王平;外源褪黑素对苹果叶片衰老的调控及相关自噬基因的功能分析[D];西北农林科技大学;2015年
5 马小卫;苹果属植物种间水分利用效率的差异及其机理研究[D];西北农林科技大学;2009年
本文编号：2801145
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