菊花花青苷代谢相关转录因子CmMYB#7和CmbHLH2鉴别及其调控机制
发布时间：2020-08-25 09:47
【摘要】：菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat)是极具观赏价值的园艺作物,花色是其重要经济性状指标。花青苷是红色系菊花的主要色素,其合成受外界环境和自身遗传调控。前人研究表明,MYB和bHLH转录因子参与调控多种植物花青苷代谢,然而菊花花青苷代谢调控关键转录因子及调控机理仍不十分明晰。本文在前期鉴别出调控花青苷代谢激活型CmMYB6成员基础上,以不同颜色早小菊‘Z1'(深红色)、‘Z2'(粉色)、‘Z3'(黄色)、白色切花菊‘Jimba’(WJ)和变红‘Jimba’(TRJ)为材料,分离鉴别了参与菊花花青苷代谢转录调控的关键成员CmbHLH2,以及参与转录调控TRJ花青苷代谢的抑制型成员CmMYB#7。主要研究结果如下:1、鉴别菊花花青苷代谢关键CmbHLH2转录因子。利用菊花EST数据库,通过进化分析和序列比对分离得到参与菊花花青苷代谢的bHLH转录因子CmbHLH2,其表达在三种不同色系早小菊'Z1'、'Z2’和'Z3'中与花青苷代谢结构基因表达呈正相关。启动子诱导实验结果表明,CmbHLH2能与CmMYB6协同激活CmDFR启动子。酵母杂交实验表明,CmbHLH2和CmMYB6均能结合CmDFR启动子序列,且CmbHLH2可与CmMYB6发生蛋白互作形成转录复合体。瞬时过表达CmbHLH2和CmMYB6能诱导烟草叶片花青苷累积。2、筛选获得菊花花青苷代谢相关MYB转录因子家族成员。利用转录组测序,克隆获得91个在‘Jimba'菊花花瓣中表达的MYBs转录因子家族成员。分析了WJ和TRJ中差异表达的MYBs转录因子,从中筛选出表达差异倍数大于4的MYBs,其中,CmMYB#17、CmMYB#16、CmMYB#39和CmMYB#85在 TRJ 中的表达高于WJ;CmMYB#7和CmMYB#15在TRJ中的表达低于WJ。分析这6个MYBs转录因子在TRJ三种不同着色程度花瓣(内层白色花瓣、中层尖红花瓣、外层全红花瓣)中的表达模式发现,除CmMYB#39外,CmMYB#17、CmMYB#16 CmMYB#39和CmMYB#85表达与花青苷合成结构基因表达呈正相关。CmMYB#7和CmMYB#15的表达与花青苷合成结构基因表达呈负相关。将这5个转录因子作为参与花青苷代谢调控研究的候选MYBs。3、阐明了 R3型MYB抑制子CmMYB#7调控菊花花青苷代谢分子机制。对上述 5 个候选 MYBs CmMYB#17、CmMYB#16、CmMYB#85、CmMYB#7 和CmMYB#15进行启动子诱导效应分析,结果表明,它们均不能单独激活或抑制花青苷合成结构基因CmDFR和CmUFGT启动子,当与CmMYB6和CmbHLH2混合时,CmMYB#7可抑制CmMYB6-CmbHLH2复合体对结构基因CmDFR和CmUFGT启动子的激活效应。酵母双杂交实验、定点突变实验及荧光素酶互补成像实验结果表明,CmMYB#7通过与CmbHLH2的竞争结合,从而抑制CmMYB6-CmbHLH2复合体对花青苷结构基因的转录激活效应。综上所述,本研究鉴别得到了 1个参与菊花花青苷代谢的bHLH转录因子,即CmbHLH2,可与花青苷激活子CmMYB6协同增强花青苷合成结构基因CmDFR启动子转录活性,进而促进花青苷合成;鉴别获得了 1个R3型花青苷抑制子CmMYB#7,可与CmMYB6竞争结合CmbHLH2抑制菊花花青苷合成结构基因CmDFR和CmUFGT启动子转录活性,参与TRJ花青苷代谢转录调控。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S682.11
【图文】：
２０１４）进行全长克隆。逡逑进化分析结果表明，与已报道花青苷合成Ｉｌｌｆ亚族ｂＨＬＨｓ聚类到逡逑同一分支（图２．１Ｂ），ＣｍｂＨＬＨ２与大丽花ＤｖｌＶＳ氨基酸序列相似度为６４％，ＤｖＪＦＳ逡逑已报道参与大丽花花青苷合成（Ｏｈｎｏ等，２０１１）。其与拟南芥ＴＴ８氨基酸序列逡逑相似度达５９％，ＴＴ８能与拟南芥ＭＹＢ转录因子ＰＡＰ１结合形成复合体调控花青逡逑苷合成（Ｄｕｂｏｓ等，２０１０）。ＣｍｂＨＬＨｌ则聚类到其他分支。逡逑结构域分析结果表明，ＣｍｂＨＬＨｌ和ＣｍｂＨＬＨ２包含一个螺旋－环－螺旋结构逡逑１７逡逑
三个品种早小菊‘ｚｒ，邋ｆＺ２’和‘Ｚ３’分别呈深红色、粉红色和黄色（图逡逑２．２Ａ）。花瓣总花青苷含量进行测定结果，Ｚ１’花青苷含量为２．８３邋ｍｇ／ｇＦＷ，‘Ｚ２’逡逑花青苷含量为０．０８ｍｇ／ｇＦＷ，‘Ｚ３’中检测不到花青苷（图２．２Ｂ）。结果表明，花逡逑青苷含量差异是三个早小菊品种花色差异的原因之一。逡逑２０逡
ｐｌａｎｔ邋ｃａｒｅ在线软件分析启动子顺式作用元件发现，启动子区域包含ＭＹＢ结合元逡逑件ＭＢＳ邋（ＭＹＢ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｓｉｔｅ），及真核生物转录起始ＲＮＡ聚合酶结合位点ＴＡＴＡ逡逑盒，另外还包含一些响应光调控的顺式作用元件（图２．４）。逡逑ＴＡＴＡ逡逑逦▲邋■邋▲邋■邋■逦？—逡逑－７６９邋ｂｐ逦－８０邋ｂｐ逡逑图２．４邋ＣｍＤ／Ｗ启动子顺式作用元件分析逡逑圆形表示ＴＡＴＡ盒，三角形表示ＭＹＢ识别元件，正方形表示ｂＨＬＨ识别元件。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋ｏｆ邋ＣｍＤＦＲ逡逑Ｃｉｒｃｌｅ邋ｍｅａｎｓ邋ＴＡＴＡ邋ｂｏｘ，邋ｔｒｉａｎｇｌｅｓ邋ｍｅａｎｓ邋ＭＹＢ邋ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ，邋ｓｑｕａｒｅｓ邋ｍｅａｎｓ邋ｂＨＬＨ逡逑ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ．逡逑２．２．５逦ＣｍｂＨＬＨ２协同ＣｍＭＹＢ６结构基因ＯｗＤ／７？启动子逡逑为进一步研究ＣｗＷｉＺＪ／７和功能，将其分别构建到ｐＧｒｅｅｎｌｌ邋００２９逡逑６２－ＳＫ表达载体，将ＯｍＤＦＴ？启动子构建到ｐＧｒｅｅｎｌｌ邋０８００－ＬＵＣ载体，利用双僁逡逑光素酶实验体系分析转录因子对启动子是否存在调控作用。将和逡逑单独或混合注射本氏烟草，结果表明Ｃｗ和逡逑均不能单独激活或抑制结构基因ＣｗＤＦ／？启动子。当与花青苷激活子逡逑（Ｌｉｕ等，２０１５邋）混合后，能显著增强Ｃ／ＷＭ７５６对ＣｗＤＦｉ？启动子激逡逑活效应
本文编号：2803549
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S682.11
【图文】：
２０１４）进行全长克隆。逡逑进化分析结果表明，与已报道花青苷合成Ｉｌｌｆ亚族ｂＨＬＨｓ聚类到逡逑同一分支（图２．１Ｂ），ＣｍｂＨＬＨ２与大丽花ＤｖｌＶＳ氨基酸序列相似度为６４％，ＤｖＪＦＳ逡逑已报道参与大丽花花青苷合成（Ｏｈｎｏ等，２０１１）。其与拟南芥ＴＴ８氨基酸序列逡逑相似度达５９％，ＴＴ８能与拟南芥ＭＹＢ转录因子ＰＡＰ１结合形成复合体调控花青逡逑苷合成（Ｄｕｂｏｓ等，２０１０）。ＣｍｂＨＬＨｌ则聚类到其他分支。逡逑结构域分析结果表明，ＣｍｂＨＬＨｌ和ＣｍｂＨＬＨ２包含一个螺旋－环－螺旋结构逡逑１７逡逑
三个品种早小菊‘ｚｒ，邋ｆＺ２’和‘Ｚ３’分别呈深红色、粉红色和黄色（图逡逑２．２Ａ）。花瓣总花青苷含量进行测定结果，Ｚ１’花青苷含量为２．８３邋ｍｇ／ｇＦＷ，‘Ｚ２’逡逑花青苷含量为０．０８ｍｇ／ｇＦＷ，‘Ｚ３’中检测不到花青苷（图２．２Ｂ）。结果表明，花逡逑青苷含量差异是三个早小菊品种花色差异的原因之一。逡逑２０逡
ｐｌａｎｔ邋ｃａｒｅ在线软件分析启动子顺式作用元件发现，启动子区域包含ＭＹＢ结合元逡逑件ＭＢＳ邋（ＭＹＢ邋ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｓｉｔｅ），及真核生物转录起始ＲＮＡ聚合酶结合位点ＴＡＴＡ逡逑盒，另外还包含一些响应光调控的顺式作用元件（图２．４）。逡逑ＴＡＴＡ逡逑逦▲邋■邋▲邋■邋■逦？—逡逑－７６９邋ｂｐ逦－８０邋ｂｐ逡逑图２．４邋ＣｍＤ／Ｗ启动子顺式作用元件分析逡逑圆形表示ＴＡＴＡ盒，三角形表示ＭＹＢ识别元件，正方形表示ｂＨＬＨ识别元件。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋ｏｆ邋ＣｍＤＦＲ逡逑Ｃｉｒｃｌｅ邋ｍｅａｎｓ邋ＴＡＴＡ邋ｂｏｘ，邋ｔｒｉａｎｇｌｅｓ邋ｍｅａｎｓ邋ＭＹＢ邋ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ，邋ｓｑｕａｒｅｓ邋ｍｅａｎｓ邋ｂＨＬＨ逡逑ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ邋ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔｓ．逡逑２．２．５逦ＣｍｂＨＬＨ２协同ＣｍＭＹＢ６结构基因ＯｗＤ／７？启动子逡逑为进一步研究ＣｗＷｉＺＪ／７和功能，将其分别构建到ｐＧｒｅｅｎｌｌ邋００２９逡逑６２－ＳＫ表达载体，将ＯｍＤＦＴ？启动子构建到ｐＧｒｅｅｎｌｌ邋０８００－ＬＵＣ载体，利用双僁逡逑光素酶实验体系分析转录因子对启动子是否存在调控作用。将和逡逑单独或混合注射本氏烟草，结果表明Ｃｗ和逡逑均不能单独激活或抑制结构基因ＣｗＤＦ／？启动子。当与花青苷激活子逡逑（Ｌｉｕ等，２０１５邋）混合后，能显著增强Ｃ／ＷＭ７５６对ＣｗＤＦｉ？启动子激逡逑活效应
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 葛翠莲;黄春辉;徐小彪;;果实花青素生物合成研究进展[J];园艺学报;2012年09期
2 戴灿;苗聪秀;卢光t;;基于重叠延伸PCR法的定点突变技术[J];现代生物医学进展;2010年03期
3 温广宇,朱文学;天然植物色素的提取与开发应用[J];河南科技大学学报(农学版);2003年02期
本文编号：2803549
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