新疆枣果黑斑病菌交链格孢菌产生毒素种类及其致病作用研究

发布时间：2020-09-03 08:48

　　目的:明确新疆红枣缩果病和枣果黑斑病病菌主要种类及其生物学特性,同时对获得的主要病原菌产生毒素的种类和含量进行分析,并对病原菌毒素导致红枣发病的机制进行分析,为新疆红枣黑斑病的防治提供依据。方法:从新疆主要红枣种植区采集典型枣缩果病和枣果黑斑病病果实样品,进行分离、纯化,并离体测定各分离菌株的致病性。采用形态学与分子生物学(rDNA-ITS、EF-1α、β-tubulin和Actin序列分析)相结合的方法对主要病原菌进行鉴定,确定病原菌种类,筛选出差异较大的代表菌株。采用超高效液相色谱串联质谱法检测代表菌株主要毒素种类及含量,并对病原物粗毒素致病机理进行研究。结果:1、从新疆红枣主要种植区哈密、阿克苏和巴音郭楞蒙古自治州分别采集红枣缩果病样品95份和枣果黑斑病样品77份。从缩果病样品中分离获得90株分离物,从枣果黑斑病样品中分离获得49株分离物。在139株分离物中,链格孢菌131株,占94.25%;镰刀菌6株,占4.32%;青霉菌2株,占1.44%。将分离物离体接种健康枣果,进行致病性测定,仅链格孢属菌可致枣果发病,说明链格孢菌是这两种病害的主要致病菌。2、通过代表菌株形态学鉴定,再结合18S rDNA-ITS、EF-1α和、β-tubulin和Actin四个基因的序列分析,最后将缩果病原菌和黑斑病菌鉴定为交链格孢菌Alternaria alternata(Fries)Keissle。3、采用超高效液相色谱串联质谱法检测10株交链格孢菌(A.alternata)代表菌株的4种主要链格孢菌毒素:链格孢酚(alternariol,AOH)、交链格孢酚单甲醚(alternariol monomethyl ether,AME)、交链孢烯(altenuene,ALT)和细交链格孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)。研究结果表明TeA、ALT、AME和AOH在不同发病程度枣果和人工接种条件下均有检出,其中TeA检出含量最高,范围为3.1×103-5.5×103mg/kg;AME、AOH和ALT的含量范围分别为0.6-6.4×102mg/kg,1.2-3.8×102mg/kg和0.09-5.08mg/kg。试验证明这两种病害的主要致病菌交链格孢菌(A.alternate)均可产生链格孢菌毒素,且产毒量高,危害严重,患病枣果无法安全食用,极大地影响了新疆红枣的产量及商品价值。4、通过交链格孢菌粗毒素对枣叶叶绿素含量、细胞膜透性、酶活、可溶性糖含量的影响进行致病机理研究。结果表明链格孢菌粗毒素处理枣叶后,叶绿素a含量无显著变化,叶绿素b、叶绿素总量均降低,其中代表菌株为菌株hm-35,hm-24;枣叶电解质渗漏,细胞膜透性随处理时间的延长而增强,电导率增强了一倍,枣叶细胞壁受到破坏;CAT、POD作为具有清除活性氧作用的防御酶,酶活显著降低,细胞内活性氧积累,细胞组织受到破坏;MDA活性降低,菌株92-3-1活性最低,为5.54U/mgprot,活性氧降低,起补偿作用;蔗糖、果糖和葡萄糖含量,大部分菌株均有小幅度增大,可溶性糖含量均增长,且增长幅度大,表明呼吸作用增强,营养物质发生消耗。
【学位单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S436.65
【部分图文】：

缩果病,黑斑病,巴州,枣果

哈密地区第十三师火箭农场缩果病 13 10 0 3黑斑病 10 9 0 1巴州第二师 21 团缩果病 3 3 0 0黑斑病 13 13 0 0巴州第二师 27 团缩果病 4 4 0 0黑斑病 7 6 1 0巴州第二师 30 团缩果病 12 12 0 0巴州第二师 31 团缩果病 17 17 0 0巴州第二师 33 团缩果病 12 12 0 0巴州第二师 34 团缩果病 20 19 0 1阿克苏地区第一师6 团缩果病 9 7 1 1黑斑病 19 19 0 0合计 139 131 2 6

缩果病,枣果,黑斑病,症状

.2 致病性测定结果由图 2-2 可见，枣果接种链格孢菌 5d 后，接种部位开始出现水渍状黑色圆形病斑，后逐渐扩大，变硬，枣果内部果肉分离，后期发病部位凹陷，整个果实烂。从枣缩果分离得到的致病菌引起与黑斑病菌相似症状，且离体接种枣果不现象。链格孢菌 33T11L、hm-32、hm-24、21-HB、34T11L、hm-36、hm-41、h-60、hm-35、hm-62、30-HB 等 18 株代表菌株菌引起红枣果实发病，但镰刀株 48T3L-hb 和 53T17L-S 接种枣果后未发病，因此可以判断新疆红枣缩果病和病的致病菌主要是链格孢菌。根据科赫氏法则，从发病病斑可重新分离得到相菌，而对照未分离得到任何病原菌。3 小结图 2-2 枣果黑斑病和缩果病病原菌接种症状Fig.2-2 Symptoms of jujube black spot and fruit shrink disease after inoculation with the pathog注：A.CK；B.缩果病接菌症状；C.缩果病接菌症状剖面；D.黑斑病接菌症状otes：A.CK；B. Symptom of inoculation with fruit shrink disease pathogen；C. the section of Symptom of inoculawith fruit shrink disease pathogen；D. Symptom of inoculation with jujube black spot disease pathogen

形态图,分生孢子,菌落形态,病原菌

罕分支，淡褐色至褐色，随着连续产孢作合轴式分支，33.0-75.0×4.0-5.5μm。分生孢子单生或链生，倒棍棒形，卵形，倒梨形或近椭圆形，淡褐色至褐色，表面光滑，具3-8个横膈膜，1-4个纵膈膜，分隔出略隘缩，孢身22.5-40.0×8.0-13.5μm（图3-1 E-F)。依据菌落特征、分生孢子梗、分生孢子特征和参照文献[54]，初步鉴定为A. alternata。3.2.2 分子生物学鉴定结果采用ITS、β-tubulin、ACT和EF-1α对病原菌分别扩增，得到大小约为500bp、800bp、图 3-1 病原菌菌落形态及分生孢子形态Fig.3-1 Morphology of pathogen colony and conidia注：A. PDA 上正面菌落形态；B-C. PDA 上背面菌落形态；D. 分生孢子梗形态；E. 分生孢子链 S；F. 分生孢子形态Notes: A. The face modality of A. alternata on the PDA；B-C. The back modality of A. alternata on the PDA；D. Themorphology of the meristem；E. Sporulation pattern of A. alternata；F. Conidia of A. alternata

【参考文献】