荷花花青素苷合成关键结构基因的克隆及其时空表达模式研究

发布时间：2020-09-08 10:35

　　 荷花(Nelumbo nucifera Gaertn.)是莲科莲属水生植物,为中国十大传统名花之一,荷花花姿优雅,花色美丽,观赏价值极高,且全株多个组织或器官可入药或食用,具有很高的经济价值。目前荷花虽已有红、粉、白、黄、复色等多种花色的品种,但大多数品种为深浅不一的粉色系列,色调相对单一。迄今,有关荷花花色形成分子调控机制方面的研究较少,荷花花青素苷合成途径相关的调控机制尚不明了,阻碍了荷花花色分子育种工作的进一步推进。有鉴于此,本研究以红、粉、白、黄四个花色品种为研究对象,首先进行了不同品种花瓣的花色表观分析、色素含量测定,然后克隆了荷花花青素苷合成途径中的7个关键结构基因,并分析了这些基因在不同品种不同花发育时期(蕾期、初花期、盛花期、末花期)的花瓣,同一品种不同组织(花瓣、叶、叶柄、雄蕊、心皮)中的表达差异,探讨了花青素苷合成途径关键结构基因对荷花花色形成的调控机制,为进行荷花花色改良及创新的分子育种奠定了重要的理论基础。1不同品种不同花发育时期花瓣的花色表型分析和色素含量n,定通过分析不同品种不同花发育时期花瓣的色差值、总类黄酮含量、总花青素含量变化,可知,红色及粉色品种表观花色的变化与总花青素含量的变化基本一致,但白色及黄色品种各花发育时期花瓣总花青素含量几乎为0;黄色品种不同花发育时期总类黄酮的含量高于其它品种。由此可推测红、粉色荷花花色的形成主要受花青素积累的影响,黄色荷花花色形成与黄酮醇等积累有关。2花青素苷合成途径中的关键结构基因的克隆及序列分析采用基因克隆的方式从荷花中分离出花青素苷合成途径中的7个关键结构基因。经测序比对,这7个关键结构基因分别为NnCHS、NnCHI、NnF3H、NnF3'H、NnF3'5'H、NnDFR、NnANS MiCHS开放性阅读框(ORF)为1170bp,编码389个氨基酸；NnCHI的ORF长度为630 bp,编码209个氨基酸;NnF3H的ORF为996 bp,编码331个氨基酸；NnF3'H的 ORF 为 1542bp,编码 513 个氨基酸;NnF3'5'的 ORF 为 1524bp,编码507个氨基酸;NnDFR的ORF为1029 bp,编码342个氨基酸;NnANS的ORF为1080 bp,编码389个氨基酸。在氨基酸序列的同源性比对分析中,荷花F3H及DFR与其他物种的同源性较低,荷花CHS、CHI、F3'H、F3'5'H、ANS与其他物种相关基因编码的氨基酸序列的同源性较高;系统发育树分析结果表明,荷花F3H、ANS与其他物种相关蛋白的亲缘性较远。对7个基因编码的蛋白质的基本结构进行预测,结果显示,荷花F3'H可能为亲水性蛋白；荷花CHS、CHI、F3H、DFR、ANS为酸性蛋白;荷花CHS、CHI、F3'H、DFR为稳定性蛋白;蛋白质的基本二级结构由a螺旋、延伸链、β转角、随机卷曲组成;7个蛋白质均具有相应的蛋白结构域。3荷花花青素苷合成途径中关键结构基因的表达模式首先,通过对8个看家基因的稳定性进行评价,发现荷花不同花色品种及不同花发育时期qPCR基因表达研究中最适的内参基因为EFla和ACT。在确定合适内参基因的基础上,我们对荷花花青素苷合成途径中7个结构基因的时空表达进行了检测。结果发现,在红色荷花品种中,7个关键结构基因的表达量随着花发育期呈现先增加后减少的趋势,在盛花期表达量较高;粉色荷花品种中,F3'H在不同花发育期的表达量几乎为0,其它基因则随着花发育期表达量逐渐减少;白色荷花品种不同花发育期,DFR及ANS的表达量几乎为0;黄色荷花品种不同花发育期的花瓣中几乎检测不到DFR的表达,但CHI在蕾期出现高量表达。在不同组织间,7个基因在花瓣中的表达量均显著高于其它组织。综上,在荷花花青素合成途径中,CHI、F3'H、DFR、ANS的表达量可能对花青素的合成及积累起着重要的调控作用,从而影响荷花花色的形成。
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S682.32
【部分图文】：

色的表型逡逑花色的划分逡逑个不同品种荷花包括红、粉、黄、白４种花色，其中随养花的开放，粉色品变浅，最终接近白色，表现出明显的褪色现象；红色品种在盛花期颜色较表２－１不同品种荷花盛花期花色划分逡逑ａｂ邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｌｏｗｅｒ邋ｃｏｌｏｒ邋ｃｕｌｔｉｖａｒｓ邋ｏｆ邋ｌｏｔｕｓ邋ｉｎｆｕｌｌ－ｏｐｅｎｉｎｇ邋ｓｔａｇｅ品种逦色系逦ＲＳＨＣＣ逡逑Ｃｕｌｔｉｖａｒ逦Ｃｏｌｏｒ邋ｓｃｒｉｅ逦＾红色逦５９－Ｄ逡逑／ｈｏｎｇｇｕｏｈｏｎｇ逡逑yU逦６５－Ｃ逡逑Ｘｉｎｇｈｕａｌｅｎ逡逑ｒ－ｌｆｅ逦．５５－Ｃ逡逑／ｈｕｔｅｎｇｃｕ邋ｌｙｉｎｇ逡逑秣陵秋色逦２－ｂ逡逑Ｍｏｌｉｎｇｑｉｕｓｅ

逑２．３总花青素含量逡逑由总花青素含量分析结果可知（图２－３），红花品种的总花青素含量显著高于其它逡逑花色品种，且随着花发育时期，花青素的积累量先增加后减少，在盛花期积累量较大；逡逑粉花品种各花发育时期中（图２－３邋Ｂ）含有少量的花青素，其含量也随着花发育时期呈逡逑现先增加后减少的变化趋势，在初花期花青素积累达到较高。白花品种及黄花品种不逡逑同花发育时期花瓣基本不含花青素。逡逑花青素苷是植物重要的色素类群之一，其种类及含量的差异往往决定着观赏植物逡逑不同花色的形成。在红色荷花品种花瓣中，花色的表观变化与花青素的含量密切联系，逡逑含量越高，颜色越深；粉色品种花瓣中花青素含量较低，所以花色较淡；而白花品种逡逑花色的形成很可能是因为花瓣中不含有花青素。黄色荷花中不含有花青素，说明其花逡逑色的形成可能与花青素无关。相似的

图３－２关键结构基因编码的氨基酸序列系统发生树分析逡逑Ｆｉｇ邋３－２邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ邋ｏｆ邋ｋｅｙ邋ｅｎｚｙｍｅｓ逡逑２．４荷花花青素苷合成途径关键酶的蛋白质结构分析逡逑２．４．１蛋白质的基本理化性质逡逑表３－１蛋白质的基本理化性质预测逡逑Ｔａｂｌｅ邋３－１邋Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ邋ｐｈｙｓｉｃａｌ邋ａｎｄ邋ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ逦逡逑＿邋，邋，ｒ逦．．邋．．ｒ（，逦ｍｍ邋Ｉ．逦斗系数逦总卞１均米水性逡逑击丨丨质逦分ｊＷｉｉｉ丨．：逦ｗｕ仑４电点逡逑Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ邋Ｇｒａｎｄ邋ａｖｅｒａｇｅ邋ｏｔ逡逑Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｎａｍｅ邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｗｅｉｇｈｔ邋Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ邋ｐｉ逦．逡逑ｉｎｄｅｘ逦ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ逡逑ＮｎＣＨＳ逦４２５７５．２４逦６．２４逦３７．０８逦－０．０９２逡逑ＮｎＣＨＩ逦２３３２５．６４逦５．０３逦３６．０６逦－０．１３６逡逑ＮｎＦ３Ｈ逦３７７３３．８５逦５．３２逦４６．６８逦－０．４９９逡逑ＮｎＦ３＇Ｈ逦５６４１６．３１逦８．５６逦２９．４逦０．０４０逡逑ＮｎＦ３＇５＇Ｈ逦５６３６５．８６逦９．３９逦４１．４２逦－０．０４８逡逑ＮｎＤＦＲ逦３８４７４．２８逦５．６９逦３６．２９逦－０．０９１逡逑ＮｎＡ邋ＮＳ逦４０３８６．３６逦５．６５逦４２．６３逦－０．３６７逡逑

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本文编号：2814077